細(xì)胞常見問題

1.血清中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么？

基于多年的實(shí)驗(yàn)研究，用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清以及其它血清中可能會(huì)存在以下種類的沉淀物：：（1）纖維蛋白，它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，可以達(dá)到1-2mm，可以用肉眼觀察到。因?yàn)檠宥际窃诘蜏叵逻M(jìn)行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體）在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當(dāng)經(jīng)過zui后的過濾分裝后，就會(huì)在瓶中凝結(jié)出現(xiàn)纖維蛋白沉淀。（2）磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會(huì)使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時(shí)候會(huì)增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點(diǎn)，這些小黑點(diǎn)由于布朗運(yùn)動(dòng)看上去可以活動(dòng)，因此經(jīng)常被誤認(rèn)為是微生物污染。（3）膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質(zhì)。他們也是血清中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。

2.血清中的沉淀物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有什么影響？

（1）細(xì)胞生長(zhǎng)，我們的試驗(yàn)以及經(jīng)驗(yàn)表明沉淀物不會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)，我們的客戶以及其它血清生產(chǎn)商也證明了這一點(diǎn)。（2）過濾，如果血清中出現(xiàn)大量的沉淀物，血清將很難過濾。一般說來，因?yàn)樵谘迳a(chǎn)時(shí)zui后已經(jīng)經(jīng)過100nm或者40nm的過濾處理，并且經(jīng)過了嚴(yán)格的無菌檢測(cè)，因此不推薦再過濾用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清。在實(shí)驗(yàn)室中沒有必要再過濾處理血清，在大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)中往往將血清直接加到培養(yǎng)基中一起過濾。（3）污染，磷酸鈣往往被誤認(rèn)為微生物污染而引起爭(zhēng)端。研究者可能會(huì)在血清中觀察到一些絮狀的沉淀，因此就會(huì)比較警覺的去做無菌試驗(yàn)，將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，結(jié)果可能會(huì)觀察到更多的絮狀沉淀，因此就斷定血清被污染了。并且當(dāng)研究者將血清樣品放在倒置顯微鏡下觀察時(shí)往往可以看到一些可以運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)，因此就更加確認(rèn)是血清被污染了。于是，研究者就會(huì)花費(fèi)更多的時(shí)間和精力來和生產(chǎn)商確認(rèn)，但zui終確定血清沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發(fā)生，我們建議不要直接將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察是否有菌，而是將血清加到瓊脂板上進(jìn)行培養(yǎng)以觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。另外，也可以進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，以確認(rèn)是否有污染。

3.如何避免血清中沉淀物的出現(xiàn)？

首先要注意正確的血清解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時(shí)間均勻而緩慢的搖動(dòng)血清。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：（1）熱滅活血清；（2）在37℃下培養(yǎng)血清；（3）反復(fù)凍融；（4）γ射線照射；（5）長(zhǎng)期儲(chǔ)存在2-8℃；（6）在室溫下放置時(shí)間過長(zhǎng)

4.如何去除血清中的沉淀？

如想去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝到無菌離心管中，以400g離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)檫@可能阻塞濾膜。

5.冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長(zhǎng)或貼附之問題。

7.一般客戶拿到細(xì)胞后，應(yīng)該注意什么？

客戶收到細(xì)胞先不開蓋，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時(shí)后（看細(xì)胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議受收細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各一張），排除細(xì)胞本身污染的情況；收到細(xì)胞未開封，出現(xiàn)污染狀況我們負(fù)責(zé)免費(fèi)發(fā)送一株細(xì)胞。

收到細(xì)胞時(shí)如無異常情況，請(qǐng)?jiān)陲@微鏡下觀察細(xì)胞密度，如為貼壁細(xì)胞，未超過80%匯合度時(shí)，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；超過80%匯合度時(shí)，請(qǐng)按細(xì)胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。如為懸浮細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后移回培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞消化液建議使用PBS配制，慎用Hanks液配制。

8.怎么樣確定細(xì)胞的質(zhì)量保障問題，能否開證明？能開什么樣的證明？如果細(xì)胞出現(xiàn)問題，客戶投訴，要求再發(fā)一株細(xì)胞，價(jià)格怎么算？

收到細(xì)胞48小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞出現(xiàn)活力狀態(tài)問題（細(xì)胞活力狀態(tài)用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力），我們受理投訴；超過48小時(shí)不超過一星期，我們收取*次細(xì)胞全款的5折后，重新發(fā)放細(xì)胞。

9.快遞細(xì)胞多久能到，是寄凍存的細(xì)胞還是復(fù)蘇好的細(xì)胞？

我們采用快遞發(fā)貨，一般外地2--3天，寄細(xì)胞前請(qǐng)確認(rèn)當(dāng)?shù)販囟?，如果氣溫低?度的，則采用郵寄凍存細(xì)胞。

10.細(xì)胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些？

（1）客戶造成細(xì)胞污染，不重發(fā)；

（2）客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

（3）非推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

（4）細(xì)胞狀態(tài)不好，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的，不重發(fā)；

（5）細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理的，不重發(fā)；

（6）細(xì)胞收到2天內(nèi)，未告知，不重發(fā)；

（7）視具體情況而定。

11.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞

12.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。

我們的細(xì)胞株所使用的培養(yǎng)液都是Gibco公司干粉配制的，均不含HEPES，所以我們建議您準(zhǔn)備同樣條件的培養(yǎng)液用于細(xì)胞培養(yǎng)。Hyclone的培養(yǎng)液請(qǐng)慎用，尤其是Hyclone液體原裝培養(yǎng)液。

13.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。

14.何謂FBS,FCS,CS,HS?

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。

15.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性

16.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

17.何時(shí)須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

19.附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。

20.懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

21.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg(約1000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

22.細(xì)胞之接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長(zhǎng)之一重要原因。

23.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

24.DMSO之等級(jí)和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO等級(jí)，必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌狀況，*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。

25.冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30-0分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20°C不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

26.細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/mlvial為宜。

27.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。

28.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？

直接滅菌后丟棄之。

29.支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。

30.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

31.偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

32.CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每?jī)芍芤淮?以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

33.為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值會(huì)越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。

34.各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長(zhǎng)差異。

35.購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建, 議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

36.購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。

37.收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

38.Hoechst 33258與Hoechst 33342都能染核，二者區(qū)別是什么？

Hoechst 33342，也稱bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式為C27H28N6O·3HCl·3H2O，分子量為615.99。Hoechst 33258，也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式為C25H24N6O·3HCl，分子量為533.88。兩種染料都是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低。但是hoechst 33342對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染活細(xì)胞時(shí)容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般來說hoechst 33258用于細(xì)胞固定后再染色，而hoechst33342則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色。