細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,也稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián),在感知和整合不同的外部刺激以產(chǎn)生生物反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,最終導(dǎo)致細(xì)胞過程(增殖、遷移、分化、營(yíng)養(yǎng)代謝……)。磷酸化反應(yīng)是由激酶介導(dǎo)的翻譯后修飾,控制參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)的活性。因此,它是感興趣途徑激活狀態(tài)的反映。
就磷酸化檢測(cè)而言,最佳檢測(cè)條件不僅取決于所研究的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及所研究的化合物(激活劑或抑制劑)的藥理學(xué)特征,還取決于用于檢測(cè)的特定細(xì)胞模型(貼壁或懸浮細(xì)胞、永生化細(xì)胞系或原代細(xì)胞、腫瘤、組織……)。正確優(yōu)化檢測(cè)條件對(duì)于確保獲得最佳的試劑使用和性能至關(guān)重要。
本文以HTRF®Advanced phospho-ERK1/2kit為例,為廣大研究者提供優(yōu)化磷酸化蛋白檢測(cè)的實(shí)用技巧,讓大家更深入地了解如何優(yōu)化過程中的各個(gè)步驟以獲得最佳的檢測(cè)結(jié)果。
圖1:Process flow for detecting GPCR-mediated ERK1/2 phosphorylation.Optimize preparation of working cells
TIP1:Optimize cell density for the best signal amplitude(優(yōu)化細(xì)胞密度)
HTRF信號(hào)與處理產(chǎn)生的磷酸化蛋白和總蛋白的量成正比,信號(hào)隨著磷酸化蛋白濃度增加而增加,如果檢測(cè)中磷酸化蛋白質(zhì)的量明顯高于孔中存在的檢測(cè)抗體的量,則信號(hào)會(huì)下降(鉤狀效應(yīng))。有必要針對(duì)每個(gè)HTRF磷酸化或總蛋白檢測(cè)試劑盒、不同的細(xì)胞模型、甚至每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行細(xì)胞密度優(yōu)化,以避免鉤狀效應(yīng)。
圖2:使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit進(jìn)行不同細(xì)胞密度檢測(cè)p-ERK,找到檢測(cè)最佳信號(hào)窗口的優(yōu)條件。每孔50K細(xì)胞密度會(huì)產(chǎn)生鉤狀效應(yīng),而每孔12.5K細(xì)胞密度條件可產(chǎn)生最佳信號(hào)。
TIP2:Optimize the presence of serum in the cell culture medium(血清饑餓處理)
根據(jù)要研究的信號(hào)通路,細(xì)胞饑餓處理可能有利于減少目標(biāo)蛋白質(zhì)的本底水平。通常情況下,從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除血清是使細(xì)胞饑餓的有效方法,但對(duì)于某些細(xì)胞模型來說,血清的存在對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖至關(guān)重要。在這種情況下,可以選擇將血清濃度降低至0.5% 或不高于2%,同時(shí)應(yīng)優(yōu)化血清饑餓的時(shí)間。
圖3:在此實(shí)驗(yàn)中,2小時(shí)血清饑餓步驟(紅色曲線)實(shí)現(xiàn)了最佳的p-ERK檢測(cè)(S/B和EC50)。
TIP3:Distribute compounds in the presence of cell culture medium(在細(xì)胞培養(yǎng)基存在的情況下進(jìn)行加藥處理)
在將化合物/藥物分配到細(xì)胞上之前,請(qǐng)勿從微孔板中除去細(xì)胞培養(yǎng)基。加藥步驟中去除培養(yǎng)基會(huì)對(duì)某些磷酸化蛋白檢測(cè)產(chǎn)生不良影響。在去除培養(yǎng)基加藥的情況下,高本底水平基本上掩蓋了任何誘導(dǎo)的藥理學(xué)劑量反應(yīng)的檢測(cè);當(dāng)培養(yǎng)基存在的情況下加藥時(shí),本底水平較低并且可以檢測(cè)到劑量反應(yīng)(見圖4)。
圖4:直接加藥或去除培養(yǎng)基后加藥的檢測(cè)對(duì)比。結(jié)果表明,為了正確檢測(cè)劑量反應(yīng),必須在細(xì)胞培養(yǎng)基存在的情況下直接加藥處理。
TIP4:Optimize stimulation time(化合物刺激時(shí)間)
評(píng)估化合物刺激時(shí)間,找出產(chǎn)生最佳信號(hào)窗口的時(shí)間。
圖5:不同藥物刺激時(shí)間后,使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit檢測(cè)p-ERK。結(jié)果表明,刺激細(xì)胞時(shí)間過短或時(shí)間過長(zhǎng)都可能會(huì)降低信號(hào)窗口。
TIP5: Add lysis buffer shortly after removal of stimulation medium(藥物處理結(jié)束后盡快加入lysis buffer)
去除刺激介質(zhì)后延遲添加裂解緩沖液可能會(huì)影響化合物的劑量反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)中,在去除刺激緩沖液后延遲不同時(shí)間后加入裂解液—— 5、10或30分鐘。結(jié)果顯示當(dāng)延遲添加裂解緩沖液時(shí),會(huì)對(duì)磷酸化ERK的檢測(cè)到產(chǎn)生不利影響。
圖6:在裂解步驟之前去除刺激緩沖液后等待時(shí)間的影響,去除培養(yǎng)基后必須立即添加裂解緩沖液。
通過上述實(shí)用技巧分享希望能夠幫助大家獲得最佳的檢測(cè)結(jié)果,此外,瑞孚迪磷酸化檢測(cè)不僅提供HTRF方案還有Alpha方案,同時(shí)還有干貨滿滿的優(yōu)化指南供大家參考,如有需要,就請(qǐng)與我們聯(lián)系吧
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。