一、引言

熒光原位雜交技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分子細(xì)胞遺傳學(xué)工具，在現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中占據(jù)著至關(guān)重要的地位。它能夠在細(xì)胞水平上對(duì)特定的 DNA 或 RNA 序列進(jìn)行可視化分析，將分子生物學(xué)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)ISH 技術(shù)從最初的簡(jiǎn)單概念發(fā)展成為一個(gè)高度精確、廣泛應(yīng)用的技術(shù)體系，為解決基因和染色體相關(guān)的研究問(wèn)題提供了關(guān)鍵手段。無(wú)論是基礎(chǔ)研究中對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能的探索，還是臨床診斷中對(duì)疾病的早期檢測(cè)和分型，F(xiàn)ISH 技術(shù)都發(fā)揮了不可替代的作用。了解其發(fā)展歷程和應(yīng)用領(lǐng)域?qū)τ谏钊胪诰蚱錆摿屯苿?dòng)相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)步具有深遠(yuǎn)意義。

二、熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展歷程

（一）早期起源

FISH 技術(shù)的起源可以追溯到 20 世紀(jì) 60 年代的原位雜交技術(shù)（In situ hybridization，ISH）。當(dāng)時(shí)，研究人員開(kāi)始嘗試?yán)梅派湫詷?biāo)記的核酸探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的特定核酸序列。這種方法雖然具有一定的特異性，但放射性物質(zhì)的使用存在諸多不便和安全隱患，如對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的輻射危害、放射性標(biāo)記物的半衰期限制以及復(fù)雜的檢測(cè)步驟等。

（二）技術(shù)革新與熒光標(biāo)記的引入

20 世紀(jì) 80 年代，隨著分子生物學(xué)和熒光標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，研究人員開(kāi)始探索用非放射性標(biāo)記物替代放射性標(biāo)記。熒光標(biāo)記物的出現(xiàn)是一個(gè)重大突破，它具有高靈敏度、高特異性、安全性好且易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。最早的熒光原位雜交技術(shù)采用了直接標(biāo)記的熒光探針，即將熒光素直接與核酸探針結(jié)合。這種方法雖然簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，但在信號(hào)強(qiáng)度和特異性方面還存在一些問(wèn)題。

（三）技術(shù)完善與發(fā)展

隨后，間接標(biāo)記法應(yīng)運(yùn)而生。間接標(biāo)記的熒光原位雜交中，探針先與一些可以被后續(xù)識(shí)別的非熒光標(biāo)記物（如生物素）結(jié)合，然后再通過(guò)與這些標(biāo)記物特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體或其他熒光親和物質(zhì)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。這種方法大大增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度和特異性。同時(shí)，在探針設(shè)計(jì)方面，從最初的簡(jiǎn)單序列探針發(fā)展到復(fù)雜的多色探針、染色體涂抹探針（Chromosome painting probes）等，使得可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因或染色體區(qū)域，提高了檢測(cè)效率和分辨率。此外，雜交反應(yīng)條件、樣本處理方法等也在不斷優(yōu)化，使得 FISH 技術(shù)的準(zhǔn)確性和可靠性不斷提高。

三、熒光原位雜交技術(shù)的原理與實(shí)驗(yàn)流程

（一）技術(shù)原理

FISH 技術(shù)基于核酸分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。首先，將待檢測(cè)的細(xì)胞或組織樣本固定在載玻片上，保持細(xì)胞形態(tài)和核酸的完整性。然后，加入經(jīng)過(guò)標(biāo)記（熒光標(biāo)記）的核酸探針，這些探針能夠特異性地與目標(biāo)核酸序列（DNA 或 RNA）互補(bǔ)結(jié)合。在適當(dāng)?shù)碾s交條件下（如溫度、鹽濃度等），探針與目標(biāo)序列形成穩(wěn)定的雜交體。最后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，可以看到熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的位置，從而確定目標(biāo)核酸序列在細(xì)胞中的分布情況。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣本制備
對(duì)于不同類型的樣本，如細(xì)胞涂片、組織切片等，有不同的制備方法。以細(xì)胞樣本為例，首先收集細(xì)胞，然后進(jìn)行固定，常用的固定劑有甲醇 - 醋酸混合液等。固定后的細(xì)胞可以通過(guò)離心等方法收集并涂片于載玻片上。對(duì)于組織樣本，需要經(jīng)過(guò)切片、脫蠟（如果是石蠟包埋組織）等處理，使其核酸暴露以便后續(xù)雜交。

2. 探針設(shè)計(jì)與標(biāo)記
根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)合適的核酸探針。探針的長(zhǎng)度通常在幾百個(gè)堿基對(duì)到幾千個(gè)堿基對(duì)之間。對(duì)于基因特異性探針，需要精確選擇與目標(biāo)基因互補(bǔ)的序列。在標(biāo)記方面，可以采用直接熒光標(biāo)記，如將熒光素（如 FITC、Cy3、Cy5 等）通過(guò)化學(xué)方法與探針的核苷酸結(jié)合。間接標(biāo)記則是先將探針與生物素或等標(biāo)記物結(jié)合，然后再通過(guò)熒光標(biāo)記的親和物質(zhì)（如熒光標(biāo)記的抗生物素抗體或抗體）來(lái)檢測(cè)。

3. 雜交反應(yīng)
將標(biāo)記好的探針加入到制備好的樣本上，在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交緩沖液中含有合適的鹽濃度、甲酰胺等成分，以調(diào)節(jié)雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性。雜交溫度和時(shí)間根據(jù)探針和目標(biāo)序列的特性而定，一般在 37℃ - 42℃之間，時(shí)間可以從幾個(gè)小時(shí)到過(guò)夜不等。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件可以保證探針與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合，減少非特異性雜交信號(hào)。

4. 洗滌與檢測(cè)
雜交完成后，需要進(jìn)行洗滌步驟，去除未結(jié)合的探針和非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。洗滌條件根據(jù)雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性來(lái)調(diào)整，一般采用不同濃度的鹽溶液在適當(dāng)溫度下進(jìn)行多次洗滌。對(duì)于直接標(biāo)記的探針，可以直接在熒光顯微鏡下觀察。對(duì)于間接標(biāo)記的探針，需要加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記親和物質(zhì)，孵育后再進(jìn)行洗滌，然后在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，可以根據(jù)熒光信號(hào)的顏色、強(qiáng)度和位置來(lái)分析目標(biāo)序列的情況。如果使用多色 FISH，則需要對(duì)不同顏色的熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別和分析，以獲取更復(fù)雜的信息。

四、熒光原位雜交技術(shù)的多元應(yīng)用

（一）基因定位

在基因組研究中，FISH 技術(shù)可用于確定特定基因在染色體上的位置。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)基因的探針，并與染色體進(jìn)行雜交，可以直觀地觀察到基因所在的染色體區(qū)域。這對(duì)于構(gòu)建基因圖譜、研究基因的連鎖關(guān)系以及了解基因在染色體上的排列順序具有重要意義。例如，在研究一些遺傳性疾病相關(guān)基因時(shí)，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以幫助確定基因與已知染色體標(biāo)記的相對(duì)位置，為進(jìn)一步的基因克隆和功能研究提供線索。

（二）染色體異常檢測(cè)

1. 數(shù)目異常檢測(cè)
FISH 技術(shù)可用于檢測(cè)染色體的數(shù)目異常，如三體綜合征（如 21 - 三體綜合征、18 - 三體綜合征等）。通過(guò)使用針對(duì)特定染色體的著絲粒探針，在細(xì)胞中觀察熒光信號(hào)的數(shù)目，可以快速準(zhǔn)確地判斷染色體的數(shù)目是否正常。與傳統(tǒng)的染色體核型分析相比，F(xiàn)ISH 技術(shù)具有更高的靈敏度和更快的檢測(cè)速度，尤其適用于產(chǎn)前診斷和腫瘤細(xì)胞染色體分析等領(lǐng)域。

2. 結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)
對(duì)于染色體的結(jié)構(gòu)異常，如缺失、重復(fù)、易位、倒位等，FISH 技術(shù)也能有效檢測(cè)。例如，使用特定的基因探針或染色體片段探針，可以檢測(cè)基因的缺失或重復(fù)情況。在腫瘤研究中，染色體易位是一種常見(jiàn)的異?，F(xiàn)象，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)易位斷點(diǎn)兩側(cè)序列的探針，觀察熒光信號(hào)的融合情況，來(lái)確定易位是否發(fā)生，為腫瘤的診斷、分型和預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

（三）腫瘤診斷與研究

1. 腫瘤診斷與分型
在腫瘤診斷中，FISH 技術(shù)可以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的染色體異常和特定基因的改變。例如，在乳腺癌中，HER - 2 基因的擴(kuò)增與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò) FISH 技術(shù)檢測(cè) HER - 2 基因的拷貝數(shù)，可以準(zhǔn)確判斷患者是否適合使用針對(duì) HER - 2 的靶向治療藥物。此外，對(duì)于一些血液系統(tǒng)腫瘤，如慢性粒細(xì)胞白血病中 BCR - ABL 融合基因的檢測(cè)，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以作為一種重要的診斷方法，區(qū)分不同類型的白血病。

2. 腫瘤預(yù)后評(píng)估
染色體異常和基因改變的情況也可以作為腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。例如，某些染色體片段的缺失或特定基因的異常表達(dá)可能預(yù)示著腫瘤患者的預(yù)后較差。FISH 技術(shù)可以對(duì)腫瘤組織進(jìn)行多參數(shù)分析，綜合評(píng)估腫瘤的預(yù)后情況，為臨床治療方案的制定提供參考。

（四）病原體檢測(cè)

FISH 技術(shù)可以用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的病原體，如病毒、細(xì)菌、支原體等。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)病原體特異性核酸序列的探針，可以在感染細(xì)胞中觀察到病原體的存在。例如，在檢測(cè)人乳頭瘤病毒（HPV）感染時(shí)，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以在宮頸細(xì)胞中檢測(cè) HPV 的 DNA，確定病毒的感染狀態(tài)和病毒類型。與傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)方法相比，F(xiàn)ISH 技術(shù)具有更高的特異性和能夠直接在細(xì)胞水平觀察病原體的優(yōu)勢(shì)，有助于深入了解病原體與宿主細(xì)胞的相互作用。

（五）產(chǎn)前診斷

在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，FISH 技術(shù)是一種重要的檢測(cè)手段。它可以用于檢測(cè)胎兒細(xì)胞中的染色體異常，如常見(jiàn)的染色體數(shù)目異常。通過(guò)采集羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞或胎兒有核紅細(xì)胞等樣本，利用 FISH 技術(shù)可以快速獲得檢測(cè)結(jié)果，為孕婦和家庭提供及時(shí)的診斷信息。與傳統(tǒng)的羊水穿刺染色體核型分析相比，F(xiàn)ISH 技術(shù)具有檢測(cè)時(shí)間短、對(duì)樣本要求相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于一些需要快速診斷的情況，如高齡孕婦、有染色體異常家族史的孕婦等。

五、結(jié)論

熒光原位雜交技術(shù)經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的發(fā)展歷程，從早期的原位雜交技術(shù)發(fā)展而來(lái)，通過(guò)引入熒光標(biāo)記和不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，已經(jīng)成為一種成熟且廣泛應(yīng)用的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。其原理基于核酸的堿基互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)流程，包括樣本制備、探針設(shè)計(jì)與標(biāo)記、雜交反應(yīng)、洗滌與檢測(cè)等步驟，可以準(zhǔn)確地在細(xì)胞水平上檢測(cè)特定的核酸序列。FISH 技術(shù)在基因定位、染色體異常檢測(cè)、腫瘤診斷與研究、病原體檢測(cè)、產(chǎn)前診斷等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了更好的應(yīng)用價(jià)值。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，如探針設(shè)計(jì)的進(jìn)一步創(chuàng)新、檢測(cè)儀器的改進(jìn)等，F(xiàn)ISH 技術(shù)有望在未來(lái)的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用，為人類健康和疾病研究做出更大的貢獻(xiàn)。同時(shí)，我們也需要不斷探索和優(yōu)化 FISH 技術(shù)，以滿足日益增長(zhǎng)的科學(xué)研究和臨床診斷需求。