一、引言

乙肝病毒（HBV）感染是全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅人類健康。HBsAg（乙肝表面抗原）在 HBV 生命周期和致病過程中發(fā)揮著復雜而關鍵的作用。其中，截短型 HBsAg 中蛋白具有更好的生物學功能，尤其是其潛在的反式激活特性，可能參與調(diào)控宿主細胞內(nèi)眾多基因的表達，進而影響病毒的復制、宿主的免疫應答以及疾病的進展。然而，目前對于截短型 HBsAg 中蛋白反式激活的具體靶基因尚未完整明確。因此，開展截短型 HBsAg 中蛋白反式激活基因克隆的研究，對于深入剖析 HBV 致病機制具有至關重要的意義，有望為乙肝的診斷和治療帶來新的突破。

二、材料與方法

（一）材料

細胞系與菌株

選擇合適的肝細胞系，如 HepG2 細胞，其具有乙肝病毒感染相關的生理特性，能夠較好地模擬體內(nèi)環(huán)境。同時，準備用于基因克隆的大腸桿菌菌株，如 DH5α，用于后續(xù)的質(zhì)粒擴增和保存。

試劑與儀器

高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶等分子生物學試劑。此外，配備核酸電泳儀、PCR 儀、基因測序儀、熒光顯微鏡等先進儀器設備。

（二）方法

截短型 HBsAg 中蛋白表達載體的構建

截短型 HBsAg 中蛋白基因片段的獲?。和ㄟ^基因合成或從 HBV 感染的臨床樣本中擴增截短型 HBsAg 中蛋白基因片段。設計特異性引物，利用 PCR 技術從提取的 HBV DNA 中擴增目的基因片段。PCR 反應條件經(jīng)過優(yōu)化，包括合適的退火溫度、延伸時間等，以確保擴增產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。

載體選擇與處理：選擇合適的真核表達載體，如 pcDNA3.1。使用特定的限制性內(nèi)切酶對載體進行雙酶切，使其線性化。酶切反應體系嚴格按照酶的說明書進行配制，確保酶切完整。

基因片段與載體的連接：將擴增得到的截短型 HBsAg 中蛋白基因片段與線性化的載體通過 T4 DNA 連接酶在合適的溫度和緩沖體系下進行連接，構建重組表達載體。連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，在含有相應抗生素的 LB 平板上篩選陽性克隆。挑取單克隆進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證，確保重組載體構建正確。

細胞轉(zhuǎn)染與篩選

細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染準備：將 HepG2 細胞培養(yǎng)在含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至合適的細胞密度。轉(zhuǎn)染前一天，將細胞接種于 6 孔板或其他合適的培養(yǎng)器皿中，使轉(zhuǎn)染時細胞達到 70 - 80% 匯合度。

轉(zhuǎn)染方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電轉(zhuǎn)染法將構建好的截短型 HBsAg 中蛋白表達載體轉(zhuǎn)染入 HepG2 細胞。對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體按照一定比例混合，在無血清培養(yǎng)基中孵育形成復合物后，加入到細胞培養(yǎng)孔中。電轉(zhuǎn)染則需優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)，如電壓、脈沖時間等，以提高轉(zhuǎn)染效率同時保證細胞存活率。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選：轉(zhuǎn)染后 48 - 72 小時，加入含有合適篩選藥物（如 G418）的培養(yǎng)基進行篩選。定期更換篩選培養(yǎng)基，直至出現(xiàn)穩(wěn)定生長的細胞克隆。挑取單克隆擴大培養(yǎng)，通過 Western blotting 或免疫熒光等方法檢測截短型 HBsAg 中蛋白的表達情況，確保獲得穩(wěn)定表達截短型 HBsAg 中蛋白的細胞株。

基因表達譜分析

總 RNA 提取：收集穩(wěn)定表達截短型 HBsAg 中蛋白的 HepG2 細胞和對照細胞（轉(zhuǎn)染空載體的細胞），使用 TRIzol 試劑或其他高效的 RNA 提取試劑盒提取總 RNA。提取過程中注意避免 RNA 酶污染，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀檢測 RNA 的完整性和濃度。

RNA 測序或基因芯片分析：采用 RNA 測序技術或基因芯片技術對兩組細胞的基因表達譜進行分析。對于 RNA 測序，構建 cDNA 文庫，使用高通量測序平臺進行測序。對于基因芯片，將標記后的 RNA 與芯片進行雜交，通過掃描芯片獲取基因表達數(shù)據(jù)。

差異表達基因篩選：對獲得的基因表達數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，通過合適的統(tǒng)計學方法篩選出在截短型 HBsAg 中蛋白表達細胞中差異表達的基因。設定合理的閾值，如倍數(shù)變化大于 2 倍且具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）的基因作為差異表達基因。

反式激活基因的克隆

候選基因的確定：根據(jù)基因表達譜分析結果，從差異表達基因中篩選出可能受截短型 HBsAg 中蛋白反式激活的候選基因。這些候選基因可能涉及細胞信號轉(zhuǎn)導、免疫調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)控等與 HBV 致病相關的生物學過程。

基因克隆策略：對于候選基因，設計特異性引物，通過 PCR 技術從基因組 DNA 或 cDNA 中擴增目的基因片段。對于基因組 DNA 擴增，需考慮基因的內(nèi)含子結構，確保擴增出完整的基因編碼序列。對于 cDNA 擴增，則可直接從總 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 中進行。擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離、純化后，連接到合適的克隆載體（如 pMD18 - T 載體）上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，通過藍白斑篩選或菌落 PCR 篩選陽性克隆。挑取陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證，確保成功克隆候選基因。

三、結果

截短型 HBsAg 中蛋白表達載體構建成功

經(jīng)過酶切鑒定和測序驗證，成功構建了含有截短型 HBsAg 中蛋白基因的真核表達載體，其序列與預期一致，為后續(xù)的細胞轉(zhuǎn)染和功能研究奠定了基礎。

穩(wěn)定表達截短型 HBsAg 中蛋白的細胞株建立

通過篩選，獲得了穩(wěn)定表達截短型 HBsAg 中蛋白的 HepG2 細胞株。Western blotting 和免疫熒光結果顯示，截短型 HBsAg 中蛋白在細胞中正確表達，且表達水平穩(wěn)定。

基因表達譜分析揭示差異表達基因

RNA 測序或基因芯片分析結果顯示，在穩(wěn)定表達截短型 HBsAg 中蛋白的細胞株中，存在大量差異表達基因。這些基因涉及多個生物學過程和信號通路，其中一些與乙肝病毒感染和致病機制密切相關。

反式激活基因克隆成功

通過對差異表達基因的篩選和克隆，成功獲得了多個可能受截短型 HBsAg 中蛋白反式激活的基因克隆。這些基因的成功克隆為進一步研究截短型 HBsAg 中蛋白的反式激活機制提供了重要的實驗材料。

四、討論

本研究通過構建截短型 HBsAg 中蛋白表達載體、建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株、分析基因表達譜以及克隆反式激活基因等一系列實驗，深入探究了截短型 HBsAg 中蛋白的反式激活作用。研究結果表明，截短型 HBsAg 中蛋白能夠顯著影響宿主細胞的基因表達，這些受調(diào)控的基因可能在 HBV 感染和致病過程中發(fā)揮重要作用。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，基因表達譜分析可能存在一定的假陽性或假陰性結果，需要進一步通過其他實驗方法進行驗證。此外，對于克隆得到的反式激活基因，其具體的作用機制和在 HBV 致病過程中的功能仍需深入研究。未來的研究可以進一步利用基因編輯技術（如 CRISPR/Cas9）對克隆得到的基因進行功能驗證，同時深入探究截短型 HBsAg 中蛋白與宿主細胞蛋白之間的相互作用，為全面理解 HBV 致病機制和開發(fā)新型抗病毒治療策略提供更堅實的理論基礎。

五、結論

綜上所述，我們成功完成了截短型 HBsAg 中蛋白反式激活基因克隆的研究。通過本研究，為深入理解 HBV 致病機制開辟了新的途徑，為乙肝的診斷和治療提供了潛在的新靶點和理論依據(jù)，有望推動乙肝防治領域的進一步發(fā)展。同時，本研究也為后續(xù)相關研究提供了重要的實驗方法和技術參考。