本文要點：光動力療法（PDT）因其非侵入性和高選擇性而成為一種有前途的腫瘤治療方法。然而，光毒性的脫靶激活和腫瘤特異性生物標志物的有限可用性等問題使PDT存在局限性 。本文介紹了一種新型比率型近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光有機納米探針BTz-IC@IR1061，該探針對腫瘤內(nèi)的次氯酸鹽（HClO）有特異性反應(yīng)。這種納米探針通過比例熒光成像來監(jiān)測和指導(dǎo)腫瘤活化PDT。BTz-IC@IR1061納米顆粒是將產(chǎn)生活性氧（ROS）的小分子染料BTz-IC與商業(yè)染料IR1061共摻雜來合成的。利用HClO可選擇性地激活 BTz-IC 的熒光和光動力特性，同時破壞 IR1061，從而控制 ROS 的釋放用于腫瘤治療。本文研究證明了納米探針對HClO的高選擇性，同時具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性、光聲成像能力和光熱能力。此外，體內(nèi)研究顯示，通過腫瘤激活的光動力療法，可以有效靶向腫瘤并顯著抑制腫瘤生長。研究結(jié)果表明 BTz-IC@IR1061 在腫瘤特異性光動力療法方面具有潛力，為精準和可控的癌癥治療提供了新的機會。

動物活體成像

方案1. 比率NIR-II FL成像引導(dǎo)激活PDT癌癥治療的示意圖

在這項研究中，構(gòu)建了一種新型比率型近紅外二區(qū)（NIR-II） 熒光 （FL） 有機納米探針 （BTz-IC@IR1061），該探針對腫瘤內(nèi)的 HClO 有反應(yīng) （方案1)。該納米探針實現(xiàn)了比率 FL 變化和 PDT 激活，PDT 的激活通過比例 NIR-II FL 變化進行監(jiān)測。納米探針由兩個主要成分組成。成分是有機小分子染料BTz-IC，它通過在傳統(tǒng)供體-受體-供體（D-A'-D）核心的兩端引入兩個受體基團，擴展共軛系統(tǒng)以實現(xiàn)NIR-II FL 發(fā)射。在光照射下，BTz-IC分子產(chǎn)生羥基自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）通過I型和II型光動力過程。第二種成分是商業(yè)花青染料IR1061。當兩個分子共摻雜時，觀察到兩個分子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），BTz-IC的光動力性能也被淬滅。與HClO一起孵育后破壞了IR1061，恢復(fù)了BTz-IC分子的熒光和光動力特性。PDT后，腫瘤部位發(fā)生炎癥，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)中性粒細胞浸潤，HClO濃度升高，進而導(dǎo)致IR1061的破壞和腫瘤中比熒光和PDT的激活。最后，比率NIR-II熒光探針可以監(jiān)測活化PDT治療腫瘤過程。

圖 1. BTz-IC分子的合成路線和表征

BTz-IC分子的合成方法如圖1a所示。紫外和可見分光光度法（UV-vis）吸收光譜表明，BTz-IC分子在730 nm處有一個特征吸收峰（圖1c）。此外，熒光光譜顯示BTz-IC分子在850 nm至1100 nm范圍內(nèi)有強烈的發(fā)射（圖1d）。此外，IR1061的吸收光譜范圍為800nm至1100nm，與BTz-IC的熒光發(fā)射范圍重疊（圖1e）。因此，兩個分子之間的FRET可以淬滅BTz-IC的熒光。為了進一步研究，使用表面活性劑DSPE-mPEG將這兩個小有機分子組裝成納米粒子（圖1b）。

最終使用的5:3比例合成了納米探針，并對其形態(tài)進行了表征。透射電子顯微鏡（TEM）圖像BTz-IC@IR1061展示了尺寸為31nm的對稱球形納米粒子（圖1h）。此外，BTz-IC@IR1061納米粒子表現(xiàn)出高水溶性，動態(tài)光散射（DLS）尺寸約為38 nm（圖1 g）。TEM和DLS尺寸一致。與此同時BTz-IC@IR1061在不同時間的不同溶劑（H2O、1640細胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS））中沒有顯著變化，表明顆粒具有良好的穩(wěn)定性。此外，測得的ζ電位為-25.1 mV。

圖2. BTz-IC@IR1061納米顆粒表征

通過用表面活性劑共摻雜這兩個分子來合成BTz-IC@IR1061在納米顆粒中，發(fā)生了FRET，淬滅了BTz-IC分子的熒光和光動力特性。在與ClO—孵育后，IR1061被破壞，從而恢復(fù)了BTz-IC分子的熒光和光動力特性（圖2a）。為了驗證納米探針對ClO—的特異性響應(yīng)，本文對探針的選擇性進行了研究。選擇了腫瘤中幾種常見且高表達的分析底物，即谷胱甘肽（GSH）、H2O2、1O2、O2·?、·OH和ClO—。納米探針分別與這些分析物一起孵育，如圖2b所示，添加其他底物（GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH）后，1064 nm處的吸收變化可以忽略不計。相比之下，隨著ClO—的加入，1064 nm處的吸收顯著降低。此外，在ClO—響應(yīng)前后測試了納米粒子的粒徑。在ClO—反應(yīng)后，納米粒子的大小沒有變化，這有效地表明只有IR1061被破壞了。通過NIR-II熒光研究了選擇性，如圖2c所示。在與GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH充分反應(yīng)后，808 nm和1064 nm激發(fā)的熒光保持不變。相反，當與ClO—反應(yīng)時，由于IR1061的破壞導(dǎo)致FRET停止，808 nm激發(fā)的熒光增加，而1064 nm激發(fā)的熒光減少。此外，計算不同ROS反應(yīng)前后808 nm/1064 nm激發(fā)的熒光比表明，添加ClO—后的熒光比為0.94，而GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH和水的熒光比分別為0.32、0.29、0.30、0.31、0.32和0.32。總之，BTz-IC@IR1061僅對ClO—顯示出高選擇性（圖2d）。

在研究了納米探針的選擇性后，研究者開始驗證BTz-IC@IR1061納米粒子在不同濃度ClO—下的反應(yīng)。將納米探針置于不同濃度的ClO—中，并測量其吸收和熒光。隨著ClO—濃度的增加，808 nm處的吸收保持不變，而1064 nm處的吸光逐漸降低。這一趨勢表明，盡管內(nèi)部參考分子BTz-IC不受影響，但IR1061逐漸被破壞。ClO—的檢測限為0.62μmol/L（圖2e）。此外，如圖2f和g所示，隨著ClO?濃度的增加，808 nm激發(fā)下的熒光增加，而1064 nm激發(fā)下的熒光減少。計算不同ClO?濃度下808 nm/1064 nm的熒光比，結(jié)果顯示，在20 μmol/L濃度下，熒光比高達123.25，而在0 μmol/L濃度時，熒光比為0.13（圖2h）。總之，該探針對ClO—表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測性能，并顯示出體內(nèi)研究的潛力。

圖3. NIR-II熒光成像監(jiān)測ClO—活化PDT

接下來，研究了ClO—激活BTz-IC@IR1061納米粒子進行光動力療法的性能，以驗證光動力療法的激活是否可以通過比率熒光監(jiān)測（圖3a）。通過使用不同濃度的ClO—與5:3的BTz-IC與IR1061反應(yīng)，驗證了PDT的激活（圖3b和c）。在808 nm激光照射30秒后，1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）在415 nm處的吸收隨著ClO—濃度的增加而顯著降低。這一結(jié)果歸因于隨著ClO—濃度的增加，納米探針之間的FRET受到更嚴重的破壞，導(dǎo)致BTz-IC分子的光動力恢復(fù)并增強。此外，計算了照射30秒后415nm處的吸收（At）與照射前的吸收（A0）之比（At/A0）（圖3d）。在ClO—濃度為20 μmol/L時，該比值為0.591，而在0μmol/L ClO—時，該比率為0.879，表明ClO—反應(yīng)后PDT激活。

根據(jù)DPBF檢測到的ROS吸收變化，即使在極低激光照射條件（0.1 W/cm2）下照射10 s，415 nm處的峰值也急劇下降。這一觀察結(jié)果表明在分子的PDT過程中產(chǎn)生了大量的ROS，能夠通過I型光動力學過程生成·OH等自由基，通過II型光動力學過程生成1O2。以5,5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物（DMPO）和4-氧代-2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）分別作為·OH和1O2的捕獲劑，通過電子自旋共振（ESR）證實了這一點。在光照射下，出現(xiàn)了TEMP/1O2加合物和DMPO/·OH加合物的特征共振信號峰，表明納米探針能夠同時生成·OH和1O2（圖3e和f）。此外，在水中加入 ClO? 進行激光照射不會引起捕獲劑的特征峰出現(xiàn)，表明 ClO? 反應(yīng)后 PDT 的激活不涉及 ClO? 與捕獲劑的反應(yīng)。因此，納米探針表現(xiàn)出優(yōu)異的 ClO? 激活 PDT 和熒光性能的恢復(fù)，這是由于 BTz-IC 和 IR1061 之間的FRET 被破壞所致。

對納米探針 BTz-IC@IR1061 的光穩(wěn)定性進行了檢測，即使在用 808 nm 激光照射 16 分鐘后，納米探針的紫外光譜仍保持不變，表明其具有良好的光穩(wěn)定性（圖 3g）。

此外，還研究了納米探針的光聲成像和光熱能力。納米探針在暴露于 808 nm 光時會產(chǎn)生熱量，與 ClO? 孵育后其光熱性能不受影響。此外，納米探針還表現(xiàn)出光聲成像能力，光譜中具有 BTz-IC和 IR1061 的特征峰（圖 3h 和 i）。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究在細胞和體內(nèi)水平上使用納米探針對腫瘤進行成像和治療奠定了基礎(chǔ)。

圖4. BTz-IC@IR1061NPs不同時間兩個通道的NIR II熒光圖像（808 nm，Em>900 nm；1064 nm，Em>1100 nm）

BTz-IC@IR1061 納米探針在 ClO? 激活的 PDT 中表現(xiàn)出良好的特性，表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性、光聲成像、光熱效應(yīng)以及產(chǎn)生 ROS 殺死癌細胞的能力。這些發(fā)現(xiàn)支持了納米探針在腫瘤 PDT 中的潛在應(yīng)用。

在驗證了納米探針在溶液和細胞中均表現(xiàn)出顯著的 PDT 特性后，對癌癥的體內(nèi)成像進行研究。研究者在 4T1 腫瘤小鼠模型中檢查了 BTz-IC@IR1061 的腫瘤富集效果。在患有皮下 4T1 腫瘤的 BALB/c 小鼠中靜脈注射 200 μL BTz-IC@IR1061 納米粒子（2 mg/mL），并在不同時間點捕獲光聲和 NIR 熒光圖像。腫瘤部位的光聲亮度隨時間逐漸增加，在注射后 8 小時達到峰值。此外，使用NIR-II熒光成像設(shè)備收集了通過靜脈注射納米粒子的小鼠熒光圖像。這些圖像顯示在808 nm和1064 nm激發(fā)下腫瘤區(qū)域的高對比度逐漸增強（圖4a），同時NIR-II熒光信號隨時間增加。值得注意的是，兩個激發(fā)通道中的熒光強度均隨時間增加。具體而言，在808 nm激發(fā)下，腫瘤區(qū)域的熒光在4小時時達到蕞大值，而在1064 nm激發(fā)下，熒光強度呈現(xiàn)初始增加，然后降低，然后再次增加的模式。此外，在靜脈注射納米粒子4小時后，腫瘤區(qū)域的熒光在808 nm處達到蕞大值，而1064 nm處的熒光蕞低（圖4b和c）。這項觀察表明，納米探針在最初到達腫瘤部位時，被腫瘤內(nèi)存在的 ClO? 部分激活，隨著時間的推移，其腫瘤富集度增加，導(dǎo)致 1064 nm 處的熒光逐漸增加。來自腫瘤區(qū)域的可辨別的 NIR-II 熒光信號表明 BTz-IC@IR1061 納米粒子通過EPR 效應(yīng)具有有效的腫瘤靶向能力。

患有 4T1 腫瘤（小鼠乳腺癌）的 BALB/c 小鼠瘤內(nèi)注射 50 μL BTz-IC@IR1061 納米探針，30 分鐘后用 808 nm 激光照射7 分鐘（0.4 W/cm2）。圖 4d中所示的結(jié)果顯示，激光照射 1 小時后，1064 nm 處誘導(dǎo)的熒光與照射前水平相比逐漸降低，而 808 nm 處誘導(dǎo)的熒光則增加。相反，未接受激光照射的小鼠的熒光信號沒有顯著變化（圖4f 和 g）。將 808 nm 和 1064 nm 之間的熒光比標準化后，觀察到腫瘤照射 1 小時后熒光比增加了約 6 倍（圖 4e）。為了研究熒光比率變化的原因，使用了商業(yè) Gr-1 熒光探針來評估照射后不同時間點腫瘤中的中性粒細胞表達。如圖 4h 所示，照射后不同時間間隔內(nèi)組織切片中 Gr-1 的熒光逐漸增加，隨后降低。這種模式可能歸因于照射后腫瘤內(nèi)的炎癥，導(dǎo)致中性粒細胞計數(shù)增加，熒光強度在 8 小時時達到峰值，隨后下降?，F(xiàn)有文獻表明，中性粒細胞計數(shù)的增加會促進腫瘤內(nèi) ClO? 濃度升高。因此，腫瘤內(nèi) ClO? 對 IR1061 的逐漸降解可能導(dǎo)致了熒光比率的變化。此外，熒光的變化可以激活 PDT，從而允許通過比率熒光的變化監(jiān)測腫瘤治療。

對BTz-IC@IR1061 納米粒子評估其在小鼠中的治療效果。對患有4T1皮下腫瘤的BALB/c小鼠進行四種治療條件：（i）PBS；（ii）808nm激光；（iii）BTz-IC@IR1061納米粒子；（iv）BTz-IC@IR1061納米粒子+808nm激光。如圖5a中的時間線所示，在腫瘤內(nèi)注射50μL BTz-IC@IR1061納米探針30分鐘后，對腫瘤進行7分鐘的預(yù)照射，一小時后進行第二次PDT治療。治療后每隔一天測量一次腫瘤體積。從腫瘤生長曲線可以看出，用BTz-IC@IR1061+808nm激光治療的小鼠表現(xiàn)出更強的抑制效果，治療14天后腫瘤消失。相反，對照組小鼠的腫瘤生長逐漸加劇（圖5b）。此外，治療14天后，各治療組小鼠體重均無明顯變化（圖5c），表明PDT對皮下腫瘤的有效性和生物安全性。治療24小時后，對腫瘤進行病理檢查。組（iv）腫瘤切片經(jīng)蘇木精和伊紅（H&E）染色后，與其他組相比病理變化明顯，進一步證實了PDT對治療實體腫瘤的有效性（圖5d）。此外，治療14天后，主要器官未見明顯異常，表明該給藥方法具有很高的生物安全性（圖5e）。

圖5. 小鼠PDT治療

總之，本研究描述了一種新型比率型 NIR-II 熒光有機納米探針，該探針被命名為 BTz-IC@IR1061。該納米探針由具有 A-D-A'-D-A 共軛結(jié)構(gòu)的有機小分子染料 BTz-IC 和商業(yè)染料 IR1061 組成。值得注意的是，BTz-IC 既可以通過 I 型光動力過程生成 ·OH，又可以通過 II 型光動力過程生成 1O2。當通過表面活性劑組裝成親水性納米顆粒時，兩種有機分子之間會發(fā)生 FRET，從而導(dǎo)致 BTz-IC 的熒光和光動力活性猝滅。當 IR1061 被 ClO? 破壞后，BTz-IC 的熒光和 PDT恢復(fù)，從而有利于比例 BTz-IC 熒光成像以監(jiān)測 PDT。此外，PDT導(dǎo)致腫瘤部位中性粒細胞浸潤，隨后HClO濃度升高，進一步導(dǎo)致NIR-II熒光比例變化并激活PDT，此外，可以通過比例型NIR-II熒光變化來監(jiān)測腫瘤PDT的治療情況。

參考文獻

Yin B, Liu X, Li Z, et al. Ratiometric NIR-II fluorescent organic nanoprobe for imaging and monitoring tumor-activated photodynamic therapy[J]. Chinese Chemical Letters, 2024: 110119.