GB/T 42430—2023血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇和正丁醇檢驗氣相色譜法

1 范圍

本文件描述了采用頂空氣相色譜(HS/GC) 和頂空氣相色譜-質(zhì)譜(HS/GC-MS) 檢驗血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇和正丁醇的方法。

本文件適用于血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空氣相色譜-質(zhì)譜定性分析和頂空氣相色譜定性定量分析。其他體液和非生物樣品可參照使用。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GA/T 122 毒物分析名詞術(shù)語

3 術(shù)語和定義

GA/T122 界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

4 原理

根據(jù)乙醇等6種化合物易揮發(fā)的特性，經(jīng)與平行操作的標準物質(zhì)比較，采用頂空氣相色譜(HS/GC) 檢測，依據(jù)兩種不同性質(zhì)色譜柱的保留時間進行定性，以峰面積為依據(jù)，內(nèi)標法或外標法定量?；虿捎庙斂諝庀嗌V-質(zhì)譜(HS/GC-MS) 檢測，依據(jù)保留時間、質(zhì)譜特征碎片離子進行定性。

5 試劑、儀器和材料

5.1 試劑

5.1.1 水，符合 GB/T 6682 規(guī)定的三級。

5.1.2 標準物質(zhì)：乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇、叔丁醇，純度均不小于99.5%。

5.1.3 10.0 mg/mL乙醇(甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇)標準物質(zhì)儲備溶液：分別精密稱取標準物質(zhì)乙醇(甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇)適量，用水配制成10.0 mg/mL 標準物質(zhì)儲備溶液，0℃~4℃保存，有效期6個月。實驗中所用其他濃度的標準溶液均由10.0 mg/mL 標準儲備溶液用水

逐級稀釋得到?；虿捎檬惺蹣藴饰镔|(zhì)溶液。

5.1.4 5.0 mg/mL 內(nèi)標物叔丁醇標準物質(zhì)儲備溶液：精密稱取500.0 mg 叔丁醇至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，0 ℃~4 ℃保存，有效期6個月。

5.1.5 0.04 mg/mL內(nèi)標物叔丁醇工作溶液：精密吸取5.0 mg/mL 內(nèi)標物叔丁醇標準物質(zhì)儲備溶液0.8 mL至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，0 ℃~4 ℃保存，有效期3個月。

5.2 儀器和材料

5.2.1 氣相色譜儀：配有氫火焰離子化檢測器(FID)。

5.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜儀：配有電子轟擊(EI) 源。

5.2.3 電子天平：分度值(d) 小于或等于0.1 mg。

5.2.4 頂空自動進樣器。

5.2.5 移液器：1.0 mL 和0.1 mL。

5.2.6 頂空進樣瓶：10 mL。

5.2.7 硅橡膠墊。

5.2.8 鋁帽。

5.2.9 密封鉗。

5.2.10 恒溫水浴鍋：控溫精度士2.0 ℃。

5.2.11 注射器：1 mL。

6 分析步驟

6.1 定性分析

6.1.1 檢材樣品制備

取檢材樣品血液或尿液100μL 及0.04 mg/mL 內(nèi)標物叔丁醇工作溶液500 μL(采用外標法時，以水代替內(nèi)標物叔丁醇工作溶液)置于頂空進樣瓶內(nèi)，蓋上硅橡膠墊，用密封鉗加封鋁帽，混勻，置于頂空自動進樣器樣品架上進樣，或置于65 ℃恒溫水浴中加熱10 min, 用 1 mL 注射器吸取瓶內(nèi)液面上氣體0.4 mL,進樣。

6.1.2 質(zhì)控樣品制備

取質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL 待測目標物標準溶液100μL, 作為添加樣品，與檢材樣品平行操作。

取水100 μL, 作為空白樣品，與檢材樣品平行操作。

6.1.3 儀器條件

6.1.3.1 氣相色譜儀參考條件

用氣相色譜法定性時應(yīng)選用兩根不同性質(zhì)的色譜柱進行分析。

以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實際情況進行調(diào)整。

a) 色譜柱型號可選擇但不限于以下四種：

1) BAC1(30m×0.32 mm×1.8μm)柱或等效色譜柱；

2) BAC2(30 m×0.32 mm×1.2 μm)柱或等效色譜柱；

3) ALC1(30m×0.32 mm×1.8 μm)柱或等效色譜柱；

4) ALC2(30 m×0.32 mm×1.2 μm)柱或等效色譜柱。

b) 柱溫：恒溫40 ℃。

c) 進樣口溫度：150 ℃。

d) 檢測器溫度：300 ℃。

e) 載氣：氮氣。

f) 柱流量：4 mL/min。

6.1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜儀參考條件

以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實際情況進行調(diào)整：

a) 色譜柱：聚乙二醇固定相(30 m×0.32 mm×0.25μm)色譜柱或等效色譜柱；

b) 柱溫：42℃保持3 min, 以25℃/min 升溫至120 ℃保持4 min;

c) 載氣：氦氣；

d) 流速：1.25 mL/min;

e) 進樣量：0.4 mL;

f) 分流比：10:1;

g) 進樣口溫度：160 ℃;

h) EI 源電壓：70 eV;

i) 溶劑延遲：1.50 min;

j) 離子源溫度：230 ℃;

k) 四極桿溫度：150 ℃;

1) 接口溫度：180℃;

m) 采集方式：全掃描(SCAN);

n) 乙醇等6種化合物及內(nèi)標物的保留時間與特征碎片離子見表1。

6.1.3.3 頂空自動進樣器參考條件

頂空自動進樣器參考條件：

a) 加熱箱溫度：65℃;

b) 定量環(huán)溫度：105℃;

c) 傳輸線溫度：110 ℃;

d) 氣相循環(huán)時間：7.5 min;

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GB/T 42430—2023

e) 樣品瓶加熱平衡時間：10.0 min;

f) 樣品瓶加壓時間：0.10 min;

g) 定量環(huán)平衡時間：0.05 min;

h) 進樣時間：1.00 min。

6.1.4 進 樣

分別取空白樣品、添加樣品和檢材樣品按6.1.3 條件進行檢測。進樣順序應(yīng)確保結(jié)果有效。

6.2 定量分析

6.2.1 樣品制備

取檢材樣品血液或尿液100 μL各兩份，按6.1.1 操作。

采用單點校正法定量，取與檢材樣品等量的目標物標準溶液各兩份，與檢材樣品平行操作，得到添加樣品，檢材樣品中目標物濃度應(yīng)在添加樣品中目標物濃度的(100±30)%內(nèi)。

采用校準曲線法定量，配制系列濃度目標物標準溶液，每個濃度取與檢材樣品等量的目標物標準溶液各兩份，得到系列濃度的添加樣品，與檢材樣品平行操作。檢材樣品中目標物濃度應(yīng)在校準曲線的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r) 不小于0.997。

6.2.2 儀器參考條件

氣相色譜儀參考條件見6.1.3.1,頂空自動進樣器參考條件見6.1.3.3。

6.2.3 進 樣

分別取檢材樣品、系列濃度的添加樣品或單點濃度的添加樣品，按6.2.2條件進樣分析。

6.2.4 結(jié)果計算

6.2.4.1 含量計算

6.2.4.1.1 內(nèi)標-校準曲線法

記錄檢材樣品和添加樣品中目標物和內(nèi)標物的峰面積值，以添加樣品中目標物與內(nèi)標物的峰面積比為縱坐標、添加樣品中目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸，得到線性方程。根據(jù)檢材樣品中目標物及內(nèi)標物的峰面積比，按公式(1)計算出檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度。

式中：

w—— 檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);

Y—— 檢材樣品中目標物與內(nèi)標物叔丁醇的峰面積比；

a 線性方程的截距；

b ——線性方程的斜率。

……… …… (1)

6.2.4.1.2 內(nèi)標-單點校正法

記錄檢材樣品和添加樣品中目標物和內(nèi)標物的峰面積值，根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標物及內(nèi)標物的峰面積，按公式(2)計算出檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度、

式中：

w —— 檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);

A —— 檢材樣品中目標物的峰面積；

A′—— 添加樣品中目標物的峰面積；

A;—— 檢材樣品中內(nèi)標物的峰面積；

A 添加樣品中內(nèi)標物的峰面積；

w’—— 添加樣品中目標物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)。

6.2.4.1.3 外標-校準曲線法

記錄檢材樣品和添加樣品中目標物的峰面積值，以添加樣品中目標物峰面積為縱坐標、添加樣品中目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸，得到線性方程。根據(jù)檢材樣品中目標物的峰面積，按公式(3)計算出檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度。

式中：

o ——檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);

Y—— 檢材樣品中目標物的峰面積；

a ——線性方程的截距；

b ——線性方程的斜率。

… … ……(3 )

6.2.4.1.4 外標-單點校正法

記錄檢材樣品和添加樣品中目標物的峰面積值，根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標物的峰面積，按公式(4)計算出檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度。

式中：

w —— 檢材樣品中目標物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);

A —— 檢材樣品中目標物的峰面積；

w’—— 添加樣品中目標物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);

A′—— 添加樣品中目標物的峰面積。

…………… ……(4 )

6.2.4.2 相對相差計算

記錄兩份平行操作的檢材樣品含量，按公式(5)計算相對相差。

公式中：RD —— 相對相差；

…… …… (5)

w1、o2——兩份檢材樣品平行定量測定的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)。

》 ——兩份檢材樣品平行定量測定的質(zhì)量濃度的平均值，單位為毫克每毫升(mg/mL)。

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7 結(jié)果評價

7.1 定性分析結(jié)果評價

7.1.1 頂空氣相色譜法定性結(jié)果評價

陽性結(jié)果評價：在相同條件下進行樣品測定時，檢材樣品中目標物的色譜峰保留時間與添加樣品一致(相對誤差在士1%之內(nèi)),空白樣品無干擾，且經(jīng)選用不同性質(zhì)的色譜柱進行分析，結(jié)果一致，則可判斷檢材樣品中檢出目標物。乙醇等6種化合物及內(nèi)標物的氣相色譜圖見附錄 A 中 圖 A.1～ 圖 A.4。陰性結(jié)果評價：檢材樣品未出現(xiàn)與添加樣品目標物一致的色譜峰，空白樣品無干擾，則可判斷檢材樣品中未檢出目標物。

7.1.2 頂空氣相色譜-質(zhì)譜法定性結(jié)果評價陽性結(jié)果評價：在相同條件下進行樣品測定時，檢材樣品中目標物的色譜峰保留時間與添加樣品一致(相對誤差在±1%之內(nèi)),且在扣除背景后的檢材樣品質(zhì)譜圖中，目標物特征碎片離子(不少于3個)與添加樣品一致，離子豐度比與濃度接近的添加樣品相比，相對誤差不超過表2規(guī)定的范圍，空白樣品無干擾，則可判斷檢材樣品中檢出目標物。陰性結(jié)果評價：檢材樣品未出現(xiàn)與添加樣品目標物一致的色譜峰，空白樣品無干擾，則可判斷檢材樣品中未檢出目標物。

7.2 定量分析結(jié)果評價

兩份檢材樣品中目標物含量的相對相差不大于1 0 % (有凝血的血樣不大于1 5 % ) ,定量數(shù)據(jù)可靠，其含量按兩份檢材的平均值計算。檢材樣品中目標物含量的相對相差大于10%(有凝血的血樣大于15%),定量數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)按6.2重新測定。

乙醇和甲醇中毒參考資料見附錄 B 和附錄

附 錄 A

(資料性)

血液、尿液中乙醇等化合物的氣相色譜圖、校準曲線、檢出限和定量限

A.1 乙醇等6種化合物及內(nèi)標物的氣相色譜圖

乙醇等6種化合物及內(nèi)標物的氣相色譜圖見圖 A.1～ 圖 A.4。

標引序號說明：

1——甲醇(1.154 min);

2——乙醇(1.450 min);

3——異丙醇(1.755 min);

4——叔丁醇(2.069 min);

5——正丙醇(2.310 min);

6——丙酮(2.542 min);

7——正丁醇(4.458 min)。 圖 A.1 在色譜柱(1)參考條件下乙醇等6種化合物及內(nèi)標物的氣相色譜圖

A.2 乙醇的參考校準曲線

配制乙醇質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL的標準溶液，按6.2分析，以乙醇與內(nèi)標物叔丁醇的峰面積比(Y) 為縱坐標、乙醇質(zhì)量濃度(w) 為橫坐標進行線性回歸。得線性回歸方程 Y=1.2409w—0.0462 (色譜柱1) ,Y=1.216 lw-0.0578(色譜柱2) ,Y=1.0307w-0.0276 (色譜柱3) ,Y=1.0287w-0.013 (色譜柱4) ,r 均不小于0.997。

若檢材樣品的濃度超出線性范圍，需用水稀釋檢材樣品或重新制作校準曲線，使檢材樣品的濃度在校準曲線的線性范圍內(nèi)。

A. 3 檢出限和定量限

本文件的 HS/GC 方法檢出限除正丙醇為0.005 mg/mL 外，其余化合物均為0.05 mg/mL; 定量限均為0.10 mg/mL。

本文件的 HS/GC-MS 方法檢出限均為0.05 mg/mL。

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