在人體內(nèi)，線粒體是我們身體的“能量中心”，它們可以將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為ATP等可用能源。除了在人體內(nèi)外動植物細胞中都能發(fā)現(xiàn)線粒體存在。通過從微生物和細胞中分離出線粒體，我們可以更好地了解其內(nèi)在機制和功能。在本文中，我們將介紹從微生物和細胞中分離線粒體的基本步驟方法。

 什么是線粒體

  自20世紀初被發(fā)現(xiàn)以來，線粒體一直被認為是細胞內(nèi)部的主要能量儲備所在。線粒體是由兩個膜界限組成的可變形的類囊體結(jié)構(gòu)，在其內(nèi)側(cè)膜中包含酶群，參與三磷酸腺苷(ATP)的形成。線粒體可進一步劃分為許多結(jié)構(gòu)不同的亞種，這些亞種通過形態(tài)和功能上的區(qū)別進行分類。盡管對線粒體的研究日趨深入，但分離線粒體的技術仍然是研究員工常常需要掌握和精通的技術。

從微生物中分離線粒體的基本步驟方法

在微生物中，將細胞產(chǎn)物進行相對簡單地分離是較為容易的。關鍵的問題在于如何有效地純化線粒體并且增加其穩(wěn)定性以進行更加深入的研究。

一、所需材料

l 酵母培養(yǎng)

l 冷凍離心機

l 15 毫升離心管

l 氯化鈉 (0.9%)

l 微量移液器

l 冰冷裂解緩沖液

l 搖床

l 線粒體儲存緩沖液

l 冰箱

l 15 ml 微量離心管

二、從微生物（酵母細胞）中分離線粒體的步驟方法：

1. 將過夜酵母培養(yǎng)物無菌轉(zhuǎn)移到兩個 15ml 離心管中。

2. 在 4°C 下以 500g 離心 10 分鐘。

3. 小心去除上清液，不要干擾沉淀。

4. 使用微量移液器在 1ml 氯化鈉 (0.9%) 中小心沖洗沉淀。

5. 使用微量移液器丟棄離心管中的氯化鈉。

6. 將沉淀重懸于 1ml 冰冷的裂解緩沖液中，并使用微量移液器充分混合。

7. 在 4°C 的搖床上孵育 10 分鐘。

8. 在 4°C 下以 1000g 離心 10 分鐘，小心去除上清液。

9. 將細胞沉淀重懸于 1.5 ml 冰冷的破碎緩沖液中，并使用針頭的鈍端完成細胞破碎。

10. 將裂解物在 4°C 下以 1000g 離心 10 分鐘。

11. 將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的 15mL 管中，并混合從步驟 7 中獲得的上清液。

12. 在 4°C 下以 6000g 離心 10 分鐘并棄去上清液。

13. 用線粒體儲存緩沖液清洗顆粒。

14. 在 4°C 下以 6000g 離心 20 分鐘。

15. 將沉淀重懸在線粒體儲存緩沖液中并儲存在 -20°C。

三、從細胞培養(yǎng)物中分離線粒體

1.所需的生物試劑/實驗試劑

l 1 升冷 STE，具有以下成分：

l 250 毫米蔗糖 = 85.58 克/升

l 5 毫米 Tris = 0.606 克/升

l 2 毫米 EGTA = 0.76 克/升

l 使用 4?C milliQ實驗室純水，pH 值至 7.4，使用 2 M HCl，置于冰上

2. 從細胞培養(yǎng)物中分離線粒體的具體方法

1. 在 3 x 500 cm2 組織培養(yǎng)板中使細胞生長至 85-95% 匯合度

2. 在生長時，吸出所有培養(yǎng)基。

3. 用 30 ml 冷 STE 清洗細胞單層，吸掉所有 STE

4. 用 30 ml 冷 STE 清洗第二次并吸出

5. 使用干凈的刀片從板表面刮下細胞單層

6. 將刮下的細胞重懸于 5 ml 冷 STE 中并轉(zhuǎn)移至離心管 (50 ml) 中。重復兩次。

7. 對所有組織培養(yǎng)板重復步驟 2-6，將細胞匯集到離心管中（每 1 個托盤 1 個管）。

8. 在 4?C 2000 rpm 下旋轉(zhuǎn)細胞 10 分鐘。

9. 小心吸出上清液（沉淀略微擴散）并保留細胞沉淀。

10. 在含有蛋白酶抑制劑和 0.5% 無脂肪酸 BSA 的 3.5 ml 冷 STE 中重懸細胞沉淀，轉(zhuǎn)移到冷的 7ml 玻璃-聚四氟乙烯勻漿器中。用 1.5 ml 含 0.5% 無脂肪酸 BSA 的 STE 洗滌試管，然后轉(zhuǎn)移至勻漿器。

11. 通過“緊密”柱塞緩慢通過 10 次使細胞勻漿，并將勻漿轉(zhuǎn)移到 50 ml 離心管中。如果需要，加滿冰冷的 STE。

12. 將勻漿在 4?C 下以 3000 rpm 的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn) 3 分鐘（1 管）

13. 通過雙層濕棉布過濾上清液，并在 4?C 下以 10000 rpm 的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn) 11 分鐘（2 管）

14. 倒出上清液并擦拭管內(nèi)壁。

15. 在冰冷的 STE 中重懸線粒體沉淀，并轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管中。加入冰冷的 STE 并以 11,600 G 旋轉(zhuǎn) 10 分鐘。

16. 使用冷試管作為杵將線粒體顆粒重新懸浮在殘留的上清液中。

17. 將線粒體放在冰上。

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