微孔濾膜過濾法（又稱膜過濾法）是指采用一定孔徑等級(jí)的無(wú)菌孔濾膜截留流體里的微生物，然后轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)。該過程常被應(yīng)用于微生物限度檢測(cè)和無(wú)菌檢測(cè)。與傳統(tǒng)平皿涂布法相比，濾膜過濾法具有不受樣品體積限制、可洗去抑制物、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

濾膜法的大致流程：用濾膜過濾待測(cè)水樣→水樣中的細(xì)菌留在濾膜上→將濾膜轉(zhuǎn)移到EMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)→統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目

 

1.濾膜與濾器的滅菌

（1）將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，于沸水浴中煮沸滅菌三次，每次15分鐘。前二次煮沸后需換水洗滌2-3次，以除去殘留的溶劑。

（2）濾器滅菌，用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用紗布和牛皮紙包裝好于121℃蒸汽下，高壓滅菌20分鐘

 

2.分離培養(yǎng)

（1）過濾水樣（海水、飲用水、自來(lái)水，水庫(kù)水及各種水源水），用滅菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣，使粗糙面向上，貼放于已滅菌的濾器上，穩(wěn)妥地固定好濾器，將水樣注入濾器內(nèi)，加蓋，打開濾器閥門，在負(fù)0.4大氣壓下抽濾，水樣抽完后，再抽氣5秒鐘，關(guān)上濾器閥門，取下濾器。

（2）用滅菌攝于夾濾膜邊緣，移放在EMB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，使濾膜的截留細(xì)菌面向上，另一面緊貼培養(yǎng)基，兩者之間不得留有氣泡，重復(fù)以上的步驟，再接種一、二個(gè)平板，倒置培養(yǎng)皿于37℃下培養(yǎng)20-24小時(shí)。

（3）原理：大腸桿菌在含有伊紅美藍(lán)的固體培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）上長(zhǎng)出的菌落呈黑色。

 

3.含量（污染程度）的計(jì)算

1毫升水樣中的大腸桿菌群數(shù)等于濾膜上生長(zhǎng)的大腸桿菌群的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，最后除以樣品的毫升數(shù)，即得。

例如，無(wú)菌操作下將90ml無(wú)菌水加入到10ml待測(cè)水樣中，這樣就將待測(cè)水樣稀釋了10倍，將稀釋后的菌液通過濾膜法測(cè)得EMB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)為45，黑色菌落為5，根據(jù)大腸桿菌鑒定的原理可知，黑色菌落為大腸桿菌，因此1升待測(cè)水樣中的大腸桿菌數(shù)目=5×（1000÷10）=500個(gè)。