Optics11生物納米壓痕儀測量生物材料基底PDMS、細(xì)胞、生物組織剛度,硬度
題目:
基體剛度對梗死邊界機(jī)械耦合和力傳播的影響
抽象
異質(zhì)細(xì)胞間耦合在心臟的機(jī)械和電信號傳輸中起著重要作用。盡管許多研究已經(jīng)研究了心肌組織內(nèi)肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞之間的電信號傳導(dǎo),但研究機(jī)械對應(yīng)物的研究并不多。本研究旨在研究在健康和心臟病發(fā)作模擬基質(zhì)僵硬條件下,底物硬度和心肌成纖維細(xì)胞(CMF)的存在對心肌細(xì)胞(CMs)和CMFs機(jī)械力傳播的影響。使用與熒光顯微鏡集成的生物納米壓痕儀測量CM產(chǎn)生的收縮力及其在CMF中的傳播,以實現(xiàn)快速鈣成像。我們的結(jié)果表明,較軟的基質(zhì)有助于更強和更進(jìn)一步的信號傳輸。有趣的是,CMF的存在以剛度依賴的方式衰減了信號傳播。與具有CMF的軟基質(zhì)相比,存在CMF的較硬基質(zhì)使信號衰減約24-32%,表明心肌梗死后基質(zhì)剛度增加和CMF數(shù)量增加對心肌功能具有協(xié)同不利影響。此外,CMF運動在CM-CMF邊界處的跳動模式也取決于基板剛度,從而影響CM產(chǎn)生的收縮力的傳播波形。我們進(jìn)行了計算機(jī)模擬,以進(jìn)一步了解不同力傳遞模式的發(fā)生,并表明在CM-CMF界面處組裝的細(xì)胞-基質(zhì)粘附(根據(jù)基板剛度而不同)在決定信號傳輸?shù)男屎蜋C(jī)制方面起著重要作用??傊?,除了底物剛度外,受底物剛度影響的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的程度和類型也會影響心肌組織中肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞之間的機(jī)械信號傳導(dǎo)。
材料和方法
納米壓痕儀實驗裝置
應(yīng)變率相關(guān)剛度測量
使用Piuma Chiaro納米壓痕系統(tǒng)(Optics11,荷蘭阿姆斯特丹)(26)測試天然心臟組織塊,具有不同剛度的PDMS底物以及PDMS底物上培養(yǎng)的CMF細(xì)胞的硬度。
使用直徑為90 μm的膠體探針測試具有不同剛度的PDMS基板。用于軟基板的壓痕探頭的彈簧常數(shù)為0.43 N/m,而用于中等和剛性基板的探頭的彈簧常數(shù)為4.21 N/m。針對每個PDMS底物條件測試了三個單獨的樣品,并從每個樣品的不同位置記錄了多個測量值。所有樣品共記錄了204-390個壓痕數(shù)據(jù)點。
用于在PDMS襯底上接種的CMF的壓痕探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別約為0.045 N / m和41 μm。針對每種底物類型,在兩個獨立樣品上總共測試了45種不同的CMF細(xì)胞。在測試之前,懸臂的靈敏度校準(zhǔn)是通過壓痕硬表面(即載玻片)進(jìn)行的。使用的加載速度分別為 50、2 和 0.2 μm/s。開發(fā)了一個定制的MATLAB代碼(The MathWorks,Natick,MA),以確定探針和樣品之間的接觸點,并使用赫茲接觸模型(27,33)識別樣品的楊氏模量:(1)其中F是施加的力,δ是壓痕深度,R是膠體探針的半徑,E是樣品的楊氏模量。假設(shè)樣品是不可壓縮的(即泊松比為0.5),因為使用該模型的文獻(xiàn)研究得出的結(jié)論是,當(dāng)泊松比從20.0到3.0(5)變化時,測量的性質(zhì)變化小于34%,因此,假設(shè)大多數(shù)生物樣品的不可壓縮性是合理的(35,36).使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計,以95%置信水平報告統(tǒng)計學(xué)意義(p < 0.05)。
收縮力測量
通過駐留實驗(23)用納米壓痕儀測量細(xì)胞片內(nèi)單個CM和CMF的收縮力。簡而言之,將納米壓痕探針與樣品接觸,并且探針的位移保持恒定(換句話說,探針駐留在樣品上)30秒以動態(tài)測量其偏轉(zhuǎn),這與電池沿橫向相對于基板的收縮力成正比。
首先,我們測量了共培養(yǎng)樣品上與CM-CMF邊界相鄰的單個CM的收縮力,以及沒有任何CMF的對照樣品上CM-PDMS邊界處的CM。然后,依次測量單個CMF的收縮力,每次在距邊界更遠(yuǎn)的距離處測量,如圖1 A所示,直到?jīng)]有可檢測到的信號。所有跳動力測量均在細(xì)胞核上進(jìn)行,以確保一致性,并盡量減少細(xì)胞剛度異質(zhì)性的影響。每次測量后,懸臂沿X軸移動,并在最近的CMF上進(jìn)行測量。因此,所有測量都是在距邊界相似的距離處進(jìn)行的,根據(jù)最近CMF的確切位置,差異僅為~5-10%。所用探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別為0.067 N/m和5.4 μm。開發(fā)了定制的 MATLAB 代碼來分離每個單拍并計算平均收縮力。
CMF 尺寸測量
為了開發(fā)本研究中的FEA模型,通過圖像分析和納米壓痕測量測量了CMF的尺寸(即細(xì)胞直徑和高度)。首先,我們通過測量新附著的球形CMF的直徑和高度來計算單個CMF的體積,該CMF在細(xì)胞接種后不超過15分鐘接種在培養(yǎng)皿上,以確保細(xì)胞仍呈球形。簡而言之,捕獲了這些球形細(xì)胞的明場圖像,并通過使用ImageJ繪制兩條從細(xì)胞中心穿過的對角線來測量直徑,以獲得D0.然后,這些球形細(xì)胞的高度,H0,通過使用納米壓痕儀壓進(jìn)細(xì)胞及其旁邊的基板并記錄細(xì)胞-基底接觸點(33)來測量。這些尺寸用于計算細(xì)胞的體積V0如下:
最后,我們測量了在不同剛度基材上播種并鋪展的CMF的高度。由于擴(kuò)散的CMF的不規(guī)則形狀,我們假設(shè)細(xì)胞體積被保留,而不管細(xì)胞的形狀調(diào)制,同時擴(kuò)散(37,38)。基于這一假設(shè)并使用第 V 卷0并測量了不同剛度基板上展開的CMF的CMF高度H,我們使用以下公式計算了不同PDMS基板上CMF的直徑D:
結(jié)果
加載速度相關(guān)的機(jī)械性能
首先,我們通過納米壓痕實驗研究了天然組織基質(zhì)、具有不同剛度的制備PDMS底物以及在這些基質(zhì)上接種的CMFs的粘彈性。我們觀察到不同PDMS基板的測量剛度的變化取決于壓痕的加載速度。PDMS基板剛度是在三種不同的加載速度(即50、2和0.2 μm/s)下測量的,如圖1 B所示。當(dāng)加載速度從50 m/s降低到2 μ m/s和從2 μm/s(p < 0.2)降低時,基體的剛度顯著降低,但軟基體的剛度從0 m/s降低到0001 μm/s(p = 50.2)時除外。同樣,在不同PDMS襯底上晶種的CMF表現(xiàn)出加載速度依賴性剛度(p <0.1484),當(dāng)加載速度從0 m/s降低到005.2 μm/s(p = 0.2)時,在中等襯底上接種的CMF除外(圖0 C)。為了進(jìn)行比較,測量了天然大鼠心臟組織的硬度,該硬度也隨著加載速度從1924降低到1.50 μm / s(p < 0.2)而降低。
PDMS襯底和在PDMS襯底上晶種的CMF均表現(xiàn)出應(yīng)變速率依賴性剛度。軟底物剛度約為13.9-17.66 kPa,與天然健康心臟組織的硬度相似(即11.33-18.46 kPa (6)),因為我們測量的健康成年大鼠心臟為13.32±8.60 kPa,而中度和僵硬底物的硬度分別為83.29-105.71和483.92-529.63 kPa,與早期研究中測量的梗死心臟組織的硬度相當(dāng)(4, 5). 同樣,在軟、中和硬基底上接種的 CMF 的剛度分別為 0.95–3.02、2.06–4.96 和 1.61–5.47 kPa??梢钥闯?,正如預(yù)期的那樣,電池剛度隨著基板剛度的增加而增加(44)。這種加載速度依賴性剛度與先前在組織和細(xì)胞(上的發(fā)現(xiàn)一致33,45)。
Optics11成立于2011年,是阿姆斯特丹自由大學(xué)(VU)的衍生組織。從那時起,這家初創(chuàng)公司的收入和員工持續(xù)增長,成為荷蘭發(fā)展最快的公司之一,并具有國際影響力。Optics11 Life提供功能強大的新型納米壓痕儀,與傳統(tǒng)的同類產(chǎn)品相比,使用方便、功能多樣、堅固耐用。主要用于測量復(fù)雜、不規(guī)則的生物材料,如單細(xì)胞、組織、水凝膠和涂層的機(jī)械性能。
Piuma Nanoindenter
生物組織、軟物質(zhì)材料力學(xué)性能測試的新方法
Piuma是功能強大的臺式儀器,可探索水凝膠、生理組織和生物工程材料的微觀機(jī)械特性。表征尺度從宏觀直至細(xì)胞。專為分析測試軟材料而設(shè)計,測量復(fù)雜和不規(guī)則材料在生理條件下的力學(xué)性能。杭州軒轅科技有限公司
主要優(yōu)勢
● 內(nèi)置攝像鏡頭,方便實時觀察樣品臺
● 實時分析計算測量結(jié)果,原始數(shù)據(jù)并將以文本文件存儲,方便任何時候?qū)隓ataviewer軟件進(jìn)行復(fù)雜處理
● 探針經(jīng)過預(yù)先校準(zhǔn),即插即用。對于時間敏感的樣品確保了快速測量
● 光纖干涉MEMS技術(shù)能夠以無損的方式測量即使是最軟的材料,并保證分辨率。同時探針可以重復(fù)使用Piuma軒轅納米壓痕儀Piuma軒轅納米壓痕儀
技術(shù)參數(shù)
模量測試范圍 | 5 Pa - 1 GPa |
探頭懸臂剛度 | 0.025 - 200 N/m |
探頭尺寸(半徑) | 3 - 250 μm |
最大壓痕深度 | 100 μm |
傳感器最大容量 | 200 |
測試環(huán)境 | air, liquid (buffer/medium) |
粗調(diào)行程 | X*Y:12×12 mm Z:12 mm |
加載模式 | Displacement / Load* / Indentation* |
測試類型 | 準(zhǔn)靜態(tài)(單點,矩陣) 蠕變,應(yīng)力松弛 DMA動態(tài)掃描 (E', E'', tanδ) |
動態(tài)掃描頻率* | 0.1 - 10 Hz |
內(nèi)置擬合模型 | Young's Modulus (Hertz / Oliver-Pharr / JKR) |
*為可選升級配置 |
Fiber-On-Top 探頭
新型光纖干涉式懸臂梁探頭,利用干涉儀來監(jiān)測懸臂梁形變。
相較于原子力顯微鏡或傳統(tǒng)納米壓痕儀
創(chuàng)新型光纖探頭,彌補了傳統(tǒng)納米壓痕儀無法測試軟物質(zhì)的問題,也解決了AFM在力學(xué)測試中的波動大,操作困難、制樣嚴(yán)苛等常見缺陷。
● 背景噪音低:激光干涉儀抗干擾強于AFM反射光路
● 制樣更簡單:對樣品的粗糙度寬容度高于AFM
● 剛度選擇更準(zhǔn)確:平行懸臂梁結(jié)構(gòu)有利于準(zhǔn)確判別壓痕深度與壓電陶瓷位移比例關(guān)系,便于選擇合適剛度探頭來保證彈性形變關(guān)系的穩(wěn)定性,進(jìn)而獲得重復(fù)率更高、準(zhǔn)確性更好的數(shù)據(jù)
內(nèi)置分析軟件
● 借助功能強大而易于操作的軟件,用戶可以自由控制壓痕程序(載荷、位移等)。自動處理曲線的流程,可以獲得數(shù)據(jù)和結(jié)果的快速分析
● 原始參數(shù)完整txt導(dǎo)出,便于后續(xù)復(fù)雜處理的需要
● 利用Hertz接觸模型從加載部分計算彈性模量,與常用的Oliver&Pharr方法相比,更為適合生物組織和軟物質(zhì)材料特性
視頻介紹
近期文獻(xiàn)
年 份 | 期 刊 | 題 目 |
---|---|---|
2022 | Advanced Functional Materials | Engineering Vascular Self-Assembly by Controlled 3D-Printed Cell Placement |
2022 | Biomaterials | Hydrogels derived from decellularized liver tissue support the growth and differentiation of cholangiocyte organoids |
2021 | Biofabrication | 3D bioprinting of tissue units with mesenchymal stem cells, retaining their proliferative and differentiating potential, in polyphosphate-containing bio-ink |
2021 | nature communications | Janus 3D printed dynamic scaffolds for nanovibration-driven bone regeneration |
2020 | Environmental Science & Technology | Effect of Nonphosphorus Corrosion Inhibitors on Biofilm Pore Structure and Mechanical Properties |
2020 | Acta Biomaterialia | A multilayer micromechanical elastic modulus measuring method in ex vivo human aneurysmal abdominal aortas |
相關(guān)產(chǎn)品
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