革蘭氏染色液試劑盒的檢驗(yàn)原理與操作步驟！

一、背景

革蘭氏染色液試劑盒可用于細(xì)菌的革蘭氏染色試驗(yàn)。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水使孔徑縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上，呈紫色。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，脫色后類脂外膜迅速溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物溶出，因此乙醇脫色后再經(jīng)番紅復(fù)染，呈紅色。

二、檢驗(yàn)原理

通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此，能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

三、操作步驟

1、涂片固定：菌液涂片時(shí)不可過于濃厚，干燥、固定。固定時(shí)通過火焰1-2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

2、染色：一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：

(1)加上結(jié)晶紫后，染色1分鐘，水洗。

(2)加上碘液后染色1分鐘，水洗。

(3)加上95%酒精，搖動(dòng)玻片，根據(jù)涂片厚度，脫色約20-60秒，水洗，吸去水分。

(4)加上番紅后，染色1分鐘，水洗。

(5)吸干或在空氣中涼干后，油鏡鏡檢。

革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，或已死亡及部分菌體自行溶解，都常呈陰性反應(yīng)。

3、結(jié)果觀察：革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以均勻分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈現(xiàn)假陽(yáng)性。

四、應(yīng)用

用于兩株革蘭氏染色性質(zhì)不同的細(xì)菌促進(jìn)碳酸鹽礦物形成的對(duì)比研究：

利用Bacillus cereus LV-1菌株（G+）和Curvibacersp.HJ-1菌株（G-）在相同培養(yǎng)基中分別進(jìn)行為期30d的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),同時(shí)利用胞外聚合物進(jìn)行了120 h的氣體擴(kuò)散實(shí)驗(yàn),測(cè)定了溶液的pH值、電導(dǎo)率、離子濃度、胞外多糖含量、碳酸酐酶活性、礦物種類和形態(tài)及其碳同位素組成等。

研究結(jié)果可以概括為以下幾點(diǎn)：（1）LV-1菌株和HJ-1菌株均具有在不含CO32-的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)碳酸鹽礦物形成的能力。前者在第30 d時(shí)形成的礦物總質(zhì)量為26.5 mg,晶體尺寸約為40μm;后者在第30d時(shí)形成的礦物總重量為14mg,晶體尺寸約為6μm。

（2）在Mg/Ca=1的培養(yǎng)基中兩株細(xì)菌均誘導(dǎo)形成方解石;在Mg/Ca=5的培養(yǎng)基中主要誘導(dǎo)形成碳鈣鎂石。

（3）LV-1菌株和HJ-1菌株誘導(dǎo)形成的礦物在形態(tài)上存在較大差異。前者形成的方解石主要呈不規(guī)則狀和立方體狀;碳鈣鎂石呈柱狀、塊狀和球狀。后者形成的方解石主要呈短桿狀、啞鈴狀、球狀;碳鈣鎂石呈六面體狀、不規(guī)則狀和長(zhǎng)板狀。

（4）革蘭氏染色性質(zhì)不同的細(xì)菌均誘導(dǎo)形成方解石,不同的是,革蘭氏陰性菌HJ-1菌株更易作為礦物的成核模板,導(dǎo)致啞鈴狀礦物的形成。革蘭氏陽(yáng)性菌LV-1菌株更易導(dǎo)致不規(guī)則狀礦物的形成。

（5）微生物代謝影響礦物中碳同位素組成。細(xì)菌介導(dǎo)的方解石δ13C=-17.410‰與胰蛋白胨的δ13C=-14.704‰比較接近,這說(shuō)明碳酸鹽礦物沉淀的碳主要來(lái)源于胰蛋白胨。

（6）胞外聚合物對(duì)碳酸鹽礦物種類和形態(tài)的影響。LV-1菌株分泌的胞外聚合物有利于高鎂方解石的形成,且大多數(shù)呈花菜狀;HJ-1菌株分泌的胞外聚合物有利于文石的形成,文石呈棱柱狀、半球狀。

（7）培養(yǎng)液中的pH值與礦物質(zhì)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系,Ca2+濃度與礦物質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明較高的pH值即溶液的堿性環(huán)境有利于碳酸鹽礦物的形成,且Ca2+濃度的下降可間接地指示礦物的生成。