本文闡述了DELFIA® EuTDA法在不同場(chǎng)景中，如：CAR-T、CAR-NK和抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC）檢測(cè)細(xì)胞殺傷功能的應(yīng)用。該方法靈敏度高，特異性好，適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，得到廣泛的認(rèn)可。

技術(shù)原理介紹
靶細(xì)胞與BATDA共孵育，BATDA進(jìn)入細(xì)胞后，被內(nèi)酯酶裂解形成TDA，親水性的TDA不能再穿過(guò)細(xì)胞膜屏障。與效應(yīng)細(xì)胞共孵育，啟動(dòng)殺傷效應(yīng)將靶細(xì)胞中的TDA釋放到上清液中，然后將其轉(zhuǎn)移到檢測(cè)板上，并化合物溶液結(jié)合生成熒光分子EuTDA。細(xì)胞裂解導(dǎo)致EuTDA的增加，因此信號(hào)的增加與標(biāo)記的靶細(xì)胞群的細(xì)胞死亡相關(guān)。

注：下文中BATDA法亦指DELFIA®EuTDA法。

CAR-T殺傷功能評(píng)價(jià)
嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞治療是適應(yīng)性免疫治療的前沿。CAR-T細(xì)胞是由T細(xì)胞設(shè)計(jì)而來(lái)的，通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞表面的相互作用來(lái)特異性地靶向腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞的激活導(dǎo)致了由CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生的細(xì)胞信號(hào)通路的增加，以幫助破壞靶向腫瘤細(xì)胞。

Zhicai Lin等人在《Evaluation of Nonviral piggyBac and lentiviral Vector in Functions of CD19 chimeric Antigen Receptor T Cells and Their Antitumor Activity for CD19+ Tumor Cells》一文中使用BATDA法評(píng)價(jià)病毒轉(zhuǎn)座子（piggyBac）和慢病毒載體（LV）轉(zhuǎn)染對(duì)CAR-T細(xì)胞殺傷的功能分析。1×105Raji細(xì)胞在37°C下用BATDA標(biāo)記30 min，后用PBS洗滌三次以去除多余的BATDA。CD19pb CAR-T細(xì)胞和CD19lv CAR-T細(xì)胞添加到BATDA標(biāo)記Raji細(xì)胞96孔V底板，效靶（E:T）比16：1，8：1，4：1，2：1和1：1，37°C，5%CO2條件下孵育4小時(shí)。取上清，加入Eu solusion，選擇酶標(biāo)儀TRF讀板。

與Mock T細(xì)胞相比，CD19pbCAR-T細(xì)胞和CD19lvCAR-T細(xì)胞均具有較高的細(xì)胞毒性。雖然CD19pbCAR-T細(xì)胞在E：T為4：1和16：1時(shí)殺死CD19+WTRaji細(xì)胞，但CD19pbCAR-T細(xì)胞在任何E：T下對(duì)CD19KORaji細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。CD19pbCAR-T細(xì)胞用于靶向CD19的ScFv具有特異性和有效性。

CAR NK殺傷功能評(píng)價(jià)
CAR-T細(xì)胞是常用的效應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型，然而使用CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療可能與危及生命的毒性作用有關(guān)，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性。此外，腫瘤細(xì)胞可能發(fā)展出免疫逃逸策略，如抗原丟失，阻止CAR-T細(xì)胞識(shí)別。相比之下，CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞是具有更多短暫毒性的短壽命細(xì)胞。此外，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性可以通過(guò)刺激和抑制受體以CAR獨(dú)立的方式，增加抗腫瘤活性。

Alejandra Leivas等人在《NKG2D-CAR-transduced natural killer cells effificiently target multiple myeloma》一文中采用BATDA法進(jìn)行體外殺傷功能檢測(cè)。NKAE和T細(xì)胞產(chǎn)物對(duì)MM細(xì)胞的EuTDA釋放試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞毒性。以U-266、L-363、OPM-2骨髓瘤細(xì)胞和原代多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞作為靶細(xì)胞，與效應(yīng)細(xì)胞按定的靶細(xì)胞（E：T)比例孵育4小時(shí)。為了檢測(cè)CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的安全性，我們以供體PBMC、CCD-18Co和NL-20細(xì)胞系為靶點(diǎn)，進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

NKAE細(xì)胞對(duì)U-266MM細(xì)胞系表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性活性，在最大E：T比值（32：1）時(shí)，破壞了77.7%的MM細(xì)胞。與NKAE細(xì)胞相比，CAR-NKAE細(xì)胞表現(xiàn)出更好的細(xì)胞毒性，在E：T為8：1已破壞*的MM細(xì)胞。與CAR T相比，CAR-NKAE對(duì)MM細(xì)胞系表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

抗體依賴的細(xì)胞毒性ADCC
在防御入侵病原體的過(guò)程中，免疫球蛋白由B細(xì)胞形成的。它們通過(guò)其Fab結(jié)構(gòu)域與病原體結(jié)合，隨后通過(guò)免疫球蛋白Fc受體激活補(bǔ)體和免疫細(xì)胞。最大的部分是免疫球蛋白γ（IgG）抗體，它通過(guò)髓系和自然殺傷（NK）細(xì)胞上的Fcγ受體（FcγR）介導(dǎo)其效應(yīng)功能。抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）是IgG的主要Fc依賴的效應(yīng)功能之一，在清除病毒感染中尤為重要，主要由NK細(xì)胞介導(dǎo)。

Steven W等人在《FcγR Binding and ADCC Activity of Human IgG Allotypes》研究中分別對(duì)抗CD20，抗CD52，抗RhD和抗TNP抗體ADCC進(jìn)行了評(píng)價(jià)。IgG2和IgG4沒(méi)有誘導(dǎo)NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC活性，這與其與FcγRIIIa的結(jié)合很弱相一致。在IgG1能有效且類(lèi)似地誘導(dǎo)ADCC（~70%殺傷），在IgG1之間沒(méi)有觀察到差異，在IgG3中，誘導(dǎo)ADCC的能力差異很大，從20%到80%，這僅與SPR測(cè)量的親和力差異部分匹配。為了確定我們的發(fā)現(xiàn)是否具有抗原依賴性，我們還在一個(gè)以TNP化紅細(xì)胞作為靶細(xì)胞的平行實(shí)驗(yàn)中分析了抗TNP IgG的ADCC能力?？筎NP ADCC數(shù)據(jù)與抗RhD抗體的ADCC數(shù)據(jù)非常相似。

DELFIA® EuTDA法綜合評(píng)價(jià)
中檢院曾發(fā)文題為《免疫細(xì)胞治療制劑體外殺傷效力評(píng)價(jià)》，文中對(duì)51Cr 、BATDA 、CAM 、CytoTox-Glo 、PKH、EliSpot和LDH法進(jìn)行了殺傷效果評(píng)價(jià)。其中51Cr同位素法是檢測(cè)殺傷的金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果總結(jié)，BATDA法與51Cr 釋放法的平行性最好，作用時(shí)間明顯縮短，可重復(fù)性高，對(duì)懸浮靶細(xì)胞和貼壁型靶細(xì)胞均具有很好的適用性?？芍貜?fù)性好，可以滿足免疫細(xì)胞體外殺傷效力檢測(cè)的需要。

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