1、引言吐溫20的化學(xué)成分是聚山梨醇酯20。它是一種非離子型表面活性劑，可用作乳化劑、分散劑、增溶劑和穩(wěn)定劑。在生物制藥行業(yè)中，聚山梨醇酯常用作蛋白乳化劑，如胰島素制劑，可減少蛋白質(zhì)之間原有的相互作用且不破壞蛋白。作為藥用輔料，應(yīng)該按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格控制吐溫的用量，避免過(guò)量使用吐溫導(dǎo)致溶血等不良后果。本文以弱陰離子交換小柱為分析柱，CAD 為檢測(cè)器，分離檢測(cè)蛋白藥物中的吐溫 20

2. 樣品前處理a) 樣品以 2.5 mL 水溶解后，直接進(jìn)樣。b) 用水溶解吐溫 20 對(duì)照品，配置成不同濃度后用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

4. 結(jié)果與討論:

（1）流動(dòng)相選擇分別采用異丙醇、甲醇、乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行洗脫試驗(yàn)。以甲醇為有機(jī)相導(dǎo)致聚山梨醇酯 20 色譜峰分叉，影響定量結(jié)果。以乙腈為有機(jī)相，相同濃度的峰高響應(yīng)值及峰形均與異丙醇分析得出的結(jié)果相似?？紤]到聚山梨醇酯 20 在乙腈中的溶解度，以及過(guò)高的乙腈會(huì)導(dǎo)致蛋白變性，最終選擇異丙醇做有機(jī)相。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相中異丙醇少于20%時(shí)，死體積處的色譜峰中含有少量未與脂肪酸鍵合的聚乙氧基山梨糖醇（見(jiàn)圖11中1號(hào)峰）。當(dāng)異丙醇含量高于 25% 時(shí)，聚山梨醇酯 20 洗脫成一個(gè)單峰。為了讓蛋白和其他賦形劑帶上正電荷，與 MAX 色譜柱產(chǎn)生離子排斥作用并死體積洗脫，將流動(dòng)相調(diào)節(jié)至低 pH 值。同時(shí)，低 pH 值下乙酸等酸性化合物變成中性分子化，不能與色譜柱發(fā)生離子交換，較快的從色譜柱中洗脫，避免干擾到聚山梨醇酯 20 的分離檢測(cè)。 

（2）檢測(cè)器選擇及條件優(yōu)化分別考察了以 RI、ELSD 和 CAD做檢測(cè)器對(duì)定量分析結(jié)果的影響。在示差折光檢測(cè)器中，只能采用等度洗脫，分析時(shí)間較長(zhǎng)且靈敏度較低。采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器分析時(shí)，Daniel Hewitt 等發(fā)現(xiàn)在進(jìn)樣 5-10 針后，基線噪音開(kāi)始顯著增加，峰面積減少，需要采用閥切換技術(shù)才能解決這一問(wèn)題。為了避免以上問(wèn)題，本文以 CAD 為檢測(cè)器，參照 Christopher C 等和 Crafts C 等在文獻(xiàn)中報(bào)道的方法對(duì)檢測(cè)器進(jìn)行優(yōu)化。分別采用 20、25、30 和 35 ℃作為氮?dú)忪F化溫度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)聚山梨醇酯 20 的保留時(shí)間與響應(yīng)差別不大。由于 30 ℃更接近于洗脫的柱溫條件，最后選用 30 ℃作為霧化溫度。同時(shí)，對(duì)采集頻率 2 Hz、5 Hz 和 10 Hz 進(jìn)行比較，隨著采集頻率增加，響應(yīng)信號(hào)增加的同時(shí)，基線噪音也大大增加。在滿(mǎn)足色譜峰大于 30 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的情況下，選用 5 Hz 作為檢測(cè)器的采集頻率。 

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線分析結(jié)果取聚山梨醇酯 20 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“4(2)”節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖見(jiàn)圖 11。以檢測(cè)器檢測(cè)到的電流值（pA）與峰寬（min）的乘積，即峰面積（pA* min）為縱坐標(biāo) Y，聚山梨醇酯 20 濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo) x，作線性擬合（見(jiàn)圖 12），得線性回歸方程為 Y=6.6429 X - 0.0445，相關(guān)系數(shù)（r）為 0.999。方法定量限（以信噪比 S/N=10 計(jì)）為 1.1 μg/mL。線性范圍為 9.4-188.0 μg/mL。

5. 前景與展望本實(shí)驗(yàn)建立了蛋白類(lèi)藥物，如某人源化單克隆抗體中聚山梨醇酯 20 的含量測(cè)定方法。經(jīng)過(guò)精密度、重復(fù)性、線性等方法學(xué)考察，表明本方法準(zhǔn)確度高，精密度、重現(xiàn)性好，在 9.4-188 μg/mL 范圍內(nèi)，線性相關(guān)較好（r = 0.999），定量限低至 1.1 μg/mL，可作為藥物及制劑中聚山梨醇酯 20 的含量測(cè)定方法。CAD 作為質(zhì)量型檢測(cè)器，當(dāng)需要檢測(cè)更低濃度樣品，可以通過(guò)適當(dāng)增大進(jìn)樣體積，或進(jìn)行柱后有機(jī)相補(bǔ)償，提高化合物的響應(yīng)，降低定量檢出限。同時(shí)，由于該檢測(cè)器響應(yīng)因子一致，可以通過(guò)聚山梨醇酯 20 的濃度同步對(duì)蛋白類(lèi)藥物進(jìn)行初步半定量分析?？傮w而言，該方法設(shè)計(jì)巧妙，原理新穎，操作使用方便，取得了較理想的結(jié)果，因此具有較好的推廣與借鑒意義