mRNA：即messenger RNA 信使RNA是由DNA經(jīng)由轉(zhuǎn)錄而來(lái)，帶著相應(yīng)的遺傳訊息，為下一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)提供所需的訊息。在細(xì)胞中，mRNA從合成到被降解，經(jīng)過(guò)了數(shù)個(gè)步驟。在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，第二型RNA聚合酶從DNA中復(fù)制出一段遺傳訊息到mRNA前體pre-mRNA上。在原核生物中，除了5'加帽之外mRNA并未被進(jìn)一步處理而經(jīng)常是邊轉(zhuǎn)錄邊轉(zhuǎn)譯。在真核生物中，轉(zhuǎn)錄跟轉(zhuǎn)譯發(fā)生在細(xì)胞的不同位置，轉(zhuǎn)錄發(fā)生在儲(chǔ)存DNA的細(xì)胞核中，而轉(zhuǎn)譯是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。

一、文庫(kù)類型

根據(jù)研究對(duì)象不同選擇相應(yīng)的建庫(kù)方法

    在測(cè)mRNA過(guò)程中，首先要去除rRNA。以人為例，在抽提的總RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的則是lncRNA、microRNA、siRNA等。rRNA整個(gè)人類當(dāng)中是非常保守的，在各個(gè)組織器官中也是非常穩(wěn)定的，因此這些測(cè)序結(jié)果對(duì)我們的研究是沒(méi)有用處的。mRNA則是RNA中比較重要的部分。

二、建庫(kù)流程

    Illumina、Kapa公司的Truseq RNA建庫(kù)方法是應(yīng)用廣泛的一種，真核普通轉(zhuǎn)錄組為例：

首先以mRNA的Poly(A)(高等生物*的)這個(gè)特點(diǎn)，讓帶有Poly(T)探針的磁珠與總RNA進(jìn)行雜交，使mRNA和磁珠相結(jié)合在一起。接著回收磁珠，將帶有Poly(A)的mRNA從磁珠上洗脫下來(lái)。

然后用鎂離子溶液將洗脫下來(lái)的mRNA打成片段，被打斷的mRNA片段用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄出鏈的cDNA，再合成出第二鏈，這樣就有了雙鏈cDNA。對(duì)雙鏈cDNA末端修復(fù)，加A加接頭。片段選擇，PCR擴(kuò)增、純化（如果樣本中存在污染物，則需要結(jié)合試劑盒進(jìn)一步純化）。

注：

    這個(gè)建庫(kù)方法對(duì)mRNA的完整性有較高要求，因此如果mRNA發(fā)生降解，那么磁珠只能吸附靠近3’端的mRNA斷片，會(huì)在富集階段被洗脫，導(dǎo)致后數(shù)據(jù)有一定的偏差（在RNA測(cè)序質(zhì)控時(shí)就能發(fā)現(xiàn)mRNA的3’端以及5’端是否有偏移）。

    一般在會(huì)測(cè)序前對(duì)總RNA進(jìn)行一次質(zhì)檢，根據(jù)電泳質(zhì)檢結(jié)果中的18S和28S（rRNA）兩個(gè)峰的高度以及峰的尖度來(lái)判斷RNA的質(zhì)量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。除了mRNA普通文庫(kù)構(gòu)建外，還有真核鏈特異性文庫(kù)、lncRNA文庫(kù)、SmallRNA文庫(kù)等。針對(duì)一些FF(Formalin-Fixed)樣本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蠟包埋樣本以及原核生物的總RNA中去除rRNA，不適合用上述mRNA建庫(kù)方法。需要結(jié)合RiboZero、RiboMinus等來(lái)去除，其實(shí)是針對(duì)rRNA序列進(jìn)行雜交捕獲去除的原理來(lái)去除的。

    Oligo(dT)₃₀磁性微球是基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則以及mRNA含有poly(A)尾巴的特點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，適用于從真核總RNA，或直接從細(xì)胞、部分病毒、動(dòng)物和植物組織的粗提物中快速分離完整的高純度mRNA。

磁性微球產(chǎn)品訂購(gòu)信息     

      產(chǎn)品名稱                                  貨號(hào)                                  儲(chǔ)存溫度                       保質(zhì)期

Oligo(dT) ₃₀ 磁性微球                    MS04T                                2-8℃                              2年

TruSeq standed mRNA Library Prep mRNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒

    KAPA mRNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒適用于illumina測(cè)序平臺(tái)，該試劑盒適用于去除了tRNA或富含poly(A)的10-400ng RNA為模板構(gòu)建RNA文庫(kù)所需的所有酶和緩沖液。

產(chǎn)品應(yīng)用：

• 基因表達(dá)；
• 新的轉(zhuǎn)錄本和SNP鑒定；
• 拼接位點(diǎn)及基因融合識(shí)別。

?產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

• 減少樣品手動(dòng)操作及總的時(shí)間
• 從100ng ~ 4ug 的靈活DNA樣本量
• KAPA HiFi酶在文庫(kù)擴(kuò)增中有強(qiáng)有力的表現(xiàn)
• 試劑及反應(yīng)體系便于自動(dòng)化操作

?Kapa試劑盒產(chǎn)品訂購(gòu)信息

品牌            貨號(hào)                                        名稱                                                             規(guī)格

KAPA        KK8420   KAPA Stranded mRNA-Seq Library Preparation Kit -illumina平臺(tái)    24sample

KAPA        KK8421   KAPA Stranded mRNA-Seq Library Preparation Kit -illumina平臺(tái)    96sample

    TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫(kù)制備試劑盒以精簡(jiǎn)、經(jīng)濟(jì)及可擴(kuò)展的方式對(duì)mRNA-Seq進(jìn)行文庫(kù)制備，可測(cè)量鏈取向。準(zhǔn)確測(cè)量基因和轉(zhuǎn)錄本豐度，并檢測(cè)編碼轉(zhuǎn)錄組中的已知特征和新特征。

產(chǎn)品英文名稱：TruSeq® Stranded mRNA Library Prep

產(chǎn)品中文名稱：TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫(kù)制備試劑盒

Illumina  TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫(kù)制備試劑盒特點(diǎn)

     TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫(kù)制備試劑盒為編碼轉(zhuǎn)錄組分析提供了一個(gè)精簡(jiǎn)、高性價(jià)比且可擴(kuò)展的解決方案。它與多種樣本兼容。

精密準(zhǔn)確

     此試劑盒可讓您測(cè)量mRNA鏈方向性以檢測(cè)反義轉(zhuǎn)錄本，并為您增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本注釋和提高比對(duì)效率。其提供高度均勻的覆蓋能力，可更好地發(fā)現(xiàn)可變剪切、基因融合和等位基因特異性表達(dá)等特征。

性價(jià)比高

     鏈信息可讓您識(shí)別RNA轉(zhuǎn)錄本來(lái)自于2條DNA鏈中的哪一條。此信息提高了轉(zhuǎn)錄本注釋的可信度，尤其針對(duì)非人類樣本。識(shí)別鏈起源可增加比對(duì)片段百分比，從而降低每個(gè)樣本的測(cè)序成本。

可擴(kuò)展

      該試劑盒能可靠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和低質(zhì)量樣本，且其工作流程可與眾多不同的研究設(shè)計(jì)兼容

Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prep產(chǎn)品訂購(gòu)信息

 品牌                       貨號(hào)                                      名稱                                             規(guī)格

Illumina             20020594         TruSeq® Stranded mRNA Library Prep              48 Samples

Illumina             20020595        TruSeq® Stranded mRNA Library Prep               96 Samples

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