小動(dòng)物活體成像，是分子影像學(xué)的一種，主要通過(guò)生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)來(lái)進(jìn)行。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。
自從1999年，美國(guó)哈佛大學(xué)Weissleder等人提出了分子影像學(xué)（molecular imaging）的概念后，科學(xué)研究已不再局限于從肉眼觀察身體、生理和代謝過(guò)程在疾病狀態(tài)下的變化，而開(kāi)始了解疾病的特異性分子事件。
與傳統(tǒng)的體外成像或細(xì)胞培養(yǎng)相比，分子映像學(xué)具有著顯著優(yōu)點(diǎn)。首先，能夠反映細(xì)胞或基因表達(dá)的空間和時(shí)間分布，第二，可以對(duì)同一個(gè)研究個(gè)體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)跟蹤成像，提高了數(shù)據(jù)的可比性，又不需要?dú)⑺滥Ｊ絼?dòng)物。第三，在藥物開(kāi)發(fā)方面，為解決臨床藥物的安全問(wèn)題提供了廣闊的空間，使藥物在臨床前研究中通過(guò)利用分子成像的方法，獲得更詳細(xì)的分子或基因水平的數(shù)據(jù)，為新藥研究的模式帶來(lái)了革命性的變革。
作為分子影像學(xué)的方法之一，小動(dòng)物活體成像技術(shù)越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用到了各個(gè)研究領(lǐng)域。這項(xiàng)技術(shù)主要就是利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，可見(jiàn)光體內(nèi)成像通過(guò)對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。另外, 這一技術(shù)對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度*，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年時(shí)間內(nèi)，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開(kāi)發(fā)等方面。
因此，獲得高質(zhì)量的生物熒光和熒光成像的圖片，對(duì)于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析是至關(guān)重要的。而這一過(guò)程中，有許多因素影響成像的效果，那么究竟是哪些因素是zui關(guān)鍵的呢？北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司在多個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，總結(jié)、分析，明確了如下幾個(gè)因素對(duì)活體成像結(jié)果起主要的影響作用：
一：CCD的性能
小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)主要包括以下幾部分，背部薄化CCD，密閉暗箱，麻醉系統(tǒng)以及軟件分析系統(tǒng)等。其中，CCD性能的好壞直接決定了圖像的質(zhì)量。而CCD的性能高低主要從以下幾個(gè)方面來(lái)考慮：分辨率、速度和強(qiáng)度。這三方面分別受不同的因子所限制，其中，分辨率主要取決于像素的多少和CCD尺寸的大?。凰俣戎饕c信噪比、靈敏度和讀出率有關(guān)；強(qiáng)度的參照指標(biāo)則為動(dòng)態(tài)范圍，如下圖：

1 CCD的尺寸和像素的大小直接影響CCD成像的能力。
大像素點(diǎn)能夠增加靈敏度，像素面積越大，對(duì)光越靈敏，因?yàn)橄袼攸c(diǎn)面積有更多電子，能產(chǎn)生更多信號(hào)。如，高bin值拍攝時(shí)，采用的大像素點(diǎn)拍攝的方法，這樣能夠獲取更多的信號(hào)，拍攝到微弱的發(fā)光點(diǎn)； 然而，隨之而來(lái)的問(wèn)題是，由于像素點(diǎn)的增大，其分辨率明顯下降，導(dǎo)致了圖像的清晰度差，甚至出現(xiàn)馬賽克現(xiàn)象。 
小像素點(diǎn)能夠增加分辨率，因此要提高影像質(zhì)量就必須增加CCD的像素，然而在CCD尺寸一定的情況下，增加了像素就意味著要縮小了像素中的光電二極管。而單位像素的面積越小，其感光性能越低，信噪比越低，動(dòng)態(tài)范圍越窄，因此采用這種方法并不能無(wú)限制地增大分辨率，所以，如果不增加CCD面積而一味地提高分辨率，只會(huì)引起圖像質(zhì)量的惡化。但如果在增加CCD像素的同時(shí)想維持現(xiàn)有的圖像質(zhì)量，就必須在至少維持單位像素面積不減小的基礎(chǔ)上增大CCD的總面積。而目前更大尺寸CCD加工制造比較困難，成品率也比較低，因此成本也一直居高不下，這也就是Roper 公司提供的Lz 2048B價(jià)格較高的原因了（Lz 2048B的CCD尺寸為27.6 x 27.6mm）。

2 動(dòng)態(tài)范圍的變化以bit值來(lái)表現(xiàn)，用來(lái)描述生成的圖像所能包含的顏色數(shù)，即灰階。深度是16位意味著圖像含有216種顏色深度的變化，這樣級(jí)別的CCD才能準(zhǔn)確表現(xiàn)所檢測(cè)到的熒光信號(hào)的微小差異，進(jìn)而在圖像上表現(xiàn)出不同的深淺或色彩差異。

3 對(duì)于同樣級(jí)別的CCD芯片來(lái)講，信噪比的高低則對(duì)zui后的成像質(zhì)量更為關(guān)鍵，因?yàn)樾旁氡炔粌H與CCD本身有關(guān)，更與系統(tǒng)的整體配置和環(huán)境密切相關(guān)。
下面這個(gè)公式顯示了信噪比（SNR）的計(jì)算方法，

從中可以看到，QE值，讀出噪聲和暗噪聲是影響SNR的主要因素，單純強(qiáng)調(diào)任何一個(gè)方面都不具有實(shí)際意義。
Roper公司生產(chǎn)的CCD，其zui大的特色就是具有非常高的量子效率。與其它廠家的CCD相比，在500-700nm范圍內(nèi)，Roper CCD的量子效率為 〉90%，即使低于在400nm和高于700nm的范圍內(nèi)，量子效率也能夠達(dá)到40%以上，這樣為獲得高質(zhì)量的圖片提供了一個(gè)必要的條件。
溫度，一直以來(lái)也是研究人員所關(guān)注的重要影響因素之一，但事實(shí)上，在信噪比的計(jì)算中，只有暗電流是與溫度相關(guān)的。一般情況下，溫度越低，因溫度產(chǎn)生的暗噪聲也就越低；但是，當(dāng)溫度降低到一定程度時(shí)，亂真電荷（spurious charge）就會(huì)出現(xiàn)，從而增加了暗電流的值。因此，溫度對(duì)于CCD來(lái)講，并不是越低越好，而是有一個(gè)*值，即：既降低了溫度帶來(lái)的噪聲，又沒(méi)有引起亂真電荷的增加。Roper公司設(shè)計(jì)生產(chǎn)的1300B，采用液氮制冷，芯片溫度控制在-110℃，其原因正在于此，這是一個(gè)保證CCD工作狀態(tài)，且不會(huì)產(chǎn)生高噪聲的*溫度。

二：實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞和基因的表達(dá)情況
對(duì)于活體成像實(shí)驗(yàn)來(lái)講，許多實(shí)驗(yàn)都涉及到了利用活細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行研究，而不同的細(xì)胞系，表達(dá)蛋白的能力也不同，因此實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞系的好壞，很大程度上影響了熒光成像的結(jié)果。 
重組基因或融合蛋白的表達(dá)情況同樣直接影響熒光的強(qiáng)弱，這個(gè)過(guò)程主要是由啟動(dòng)子的強(qiáng)弱來(lái)控制的。如果實(shí)驗(yàn)中采用了弱啟動(dòng)子，那么在熒光檢測(cè)時(shí)，很可能會(huì)導(dǎo)致熒光弱很多倍，這樣，即使有表達(dá)的部位，也可能因此而無(wú)法檢測(cè)到，北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了這一點(diǎn)。以下圖為例，A圖采用了強(qiáng)啟動(dòng)子，在平板實(shí)驗(yàn)中，20個(gè)細(xì)胞就可以在1*1 bin，60秒被檢測(cè)到，而B(niǎo)圖中所采用的弱啟動(dòng)子，在8*8 bin，60秒時(shí)卻只能檢測(cè)到1250個(gè)細(xì)胞。

三：熒光素酶成像時(shí)，底物濃度和溫度的影響

哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將熒光素酶基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。
正因?yàn)闊晒馑孛赋上袷且环N酶和底物的生化反應(yīng)，因此，生物熒光成像便不可避免地受到了底物濃度和動(dòng)物體溫度的影響。在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行底物注射時(shí)，底物濃度的高低和量的多少都會(huì)對(duì)成像的快慢和熒光的強(qiáng)弱造成影響。而活體成像系統(tǒng)的暗箱和檢測(cè)平臺(tái)都保持良好的恒溫狀態(tài)，也正是為了成像時(shí)能夠保證動(dòng)物的體溫恒定在37℃。下面兩圖直觀地說(shuō)明了底物濃度和溫度對(duì)于酶活性的影響：

綜上所述，在進(jìn)行小動(dòng)物活體成像時(shí)，必須綜合考慮各方面因素的作用，盡量將各個(gè)因素都保證在*狀態(tài)，才能得到真正高質(zhì)量的圖片。

然而，在活體成像過(guò)程，并不是總能保持各方面因素都達(dá)到*狀態(tài)，那么在這種情況下，應(yīng)該從哪些方面考慮，去獲得高質(zhì)量的圖片呢？北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司通過(guò)對(duì)一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析后，建議：
首先：構(gòu)建帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的融合表達(dá)蛋白。這是整個(gè)活體成像的*步，也是zui重要的一步。從上面的分析可以看出，啟動(dòng)子的強(qiáng)弱對(duì)于zui終圖片的獲取影響甚大，強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)熒光強(qiáng)度的提高，是任何只從CCD性能方面進(jìn)行改進(jìn)所*的。
另外，值得注意的是，在進(jìn)行平板預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要將整個(gè)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格控制，包括細(xì)胞的個(gè)數(shù)，底物的濃度以及環(huán)境的溫度等。其中，環(huán)境溫度有時(shí)會(huì)被忽視，但真正的成像是在體內(nèi)進(jìn)行的，如果平板實(shí)驗(yàn)的溫度不準(zhǔn)確，不處于酶和底物作用的*溫度，那么就可能會(huì)導(dǎo)致獲得結(jié)果的不準(zhǔn)確性，造成下一步體內(nèi)注射細(xì)胞的偏差，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下圖是不同溫度下，同樣的細(xì)胞系，同樣的個(gè)數(shù)獲得的結(jié)果，可以看到，在溫度降低后，能檢測(cè)到的細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少。而這個(gè)結(jié)果實(shí)際上并不是CCD靈敏度發(fā)生了變化，而是環(huán)境溫度的原因。

第二：在所采用的細(xì)胞系無(wú)法更改或提高其表達(dá)蛋白的能力時(shí)，應(yīng)該考慮延長(zhǎng)曝光時(shí)間。對(duì)于CCD成像來(lái)講，獲得的光子信號(hào)有一個(gè)累加效應(yīng)，因此，當(dāng)曝光時(shí)間增強(qiáng)時(shí)，微弱的光子信號(hào)得到了累加，從而可以被檢測(cè)到。
第三：曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，不僅增加了目的信號(hào)，對(duì)于噪音也存在一個(gè)累加效應(yīng)，為了避免這種情況，可以適當(dāng)?shù)脑黾觔in 值，即采用高大像素點(diǎn)進(jìn)行拍攝，這樣獲得更多的光子信號(hào)，適用于微弱信號(hào)的拍攝。

總之，了解了小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)的原理，以及影響成像的一些相關(guān)因素后，能夠幫助研究人員更容易獲得高質(zhì)量的圖片，進(jìn)而形成一篇好的科學(xué)論文。不過(guò)，儀器只是論文成功的助因，zui重要的決定因素還是在于文章是否具有創(chuàng)新性，以及文章整體內(nèi)容的豐富程度和含金量，希望我們的儀器能為科研工作者的文章增色許多。