細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗。既可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，又起到了細胞保種的作用。那么你知道細胞凍存的操作步驟是什么嗎？讓我們一起來看看吧！
實驗開始前，要先做好準(zhǔn)備工作：
將凍存管、離心管、移液管、移液器等耗材準(zhǔn)備齊全，放入超凈臺中，打開紫外線照射 30 分鐘。打開通風(fēng)機通風(fēng) 3 分鐘。用 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。將離心機調(diào)節(jié)至所需轉(zhuǎn)速，細胞完全培養(yǎng)基、DMSO、胰酶等放于37℃水浴箱中預(yù)熱。
凍存步驟：
1. 取出細胞，酒精消毒，放入超凈臺。
Tip1：應(yīng)在細胞生長良好、致密度約為 80-90%，活力達 90%以上的狀態(tài)下凍存。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。
2. 配置細胞凍存液：按無血清培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1 的比例配置細胞凍存液。【或者血清：DMSO=9：1，亦可以根據(jù)細胞特性，選擇供應(yīng)商推薦的凍存液配方】。
Tip2：DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，可以用0.22微米濾膜過濾，或者直接購買無菌產(chǎn)品。以5-10 ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
Tip3：因DMSO本身就有滅菌的作用，因此使用前不需要進行高壓滅菌。高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保存效果。
Tip4：在常溫下，DMSO對人體有害，應(yīng)注意生物安全防護。
Tip5：凍存液應(yīng)該提前配制，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細胞。
Tip6：加大凍存液中血清的比例對于保存某些脆弱的干細胞以及一些比較珍貴的細胞很有好處的。
3. 按照細胞傳代步驟，對細胞進行消化、解離。
4. 消化好的細胞離心后，棄掉上清液，用凍存液重懸。
Tip7：用移液器吸去上清液時，不要吸到底部的細胞沉淀。
Tip8：用移液器輕柔吹打細胞，避免損傷細胞。
Tip9：混勻 DMSO 要快，因為 DMSO 對細胞有毒性，混合后應(yīng)盡快凍存。
5. 可用細胞計數(shù)板或計數(shù)儀器對細胞進行計數(shù)，將細胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細胞數(shù)量為5×105/ml為宜。
6. 將細胞凍存懸液分裝入細胞凍存管中，一般2ml凍存管裝入 1 -1.5 ml細胞凍存懸液為宜。
7. 放入專業(yè)的細胞凍存盒中，或者按照：
﹣4 ℃ 30分鐘→20℃ 30分鐘→﹣80℃過夜→液氮保存的順序進行凍存。
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