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隨著CAR-T治療的火熱，細(xì)胞和基因治療也進(jìn)入了白re化的狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)就稱(chēng)為通向CAR-T治療的第一步。貼壁細(xì)胞如何進(jìn)行傳代培養(yǎng)？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、所需材料

 ★  裝有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)容器

 ★  經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)

 ★  wan全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，預(yù)熱至 37℃

 ★  一次性無(wú)菌15ml試管

 ★  37 ℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為 5%的濕化空氣

 ★  平衡鹽溶液，例如: 杜爾貝科磷酸鹽緩沖液 (DPBS)，不含鈣、鎂和酚紅消化酶，例如：胰蛋百酶，不含酚紅

二、貼壁細(xì)胞傳代流程

細(xì)胞培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風(fēng)30min，操作前需要換細(xì)胞間專(zhuān)用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實(shí)驗(yàn)服，戴上一次性口罩和帽子，整個(gè)無(wú)菌操作都應(yīng)該在酒精燈的周?chē)M(jìn)行。

1. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞，棄掉舊培養(yǎng)基；

2. 用磷酸鹽緩沖液 (PBS)沖洗細(xì)胞1-2遍。 (每10cm²培養(yǎng)表面積需要2ml 溶液)。從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次；注:沖洗步驟可去除可能抑制消化酶作用的少量血清鈣和鎂。

3. 從培養(yǎng)容器中吸出沖洗液并丟棄；

4. 向培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱的消化酶(例如:胰蛋白酶);試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層(每10cm²大約0.5ml)。輕輕搖晃容器，使試劑wan全覆蓋細(xì)胞層；

5. 將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約2分鐘；

請(qǐng)注意，實(shí)際孵育時(shí)間根據(jù)所用細(xì)胞系不同可能有所差異。

6. 在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞解離情況。如果解離程度未達(dá)90%，可將孵育時(shí)間延長(zhǎng)幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細(xì)胞解離。

7. 細(xì)胞解離程度大于等于90%時(shí)，傾斜培養(yǎng)容器，使細(xì)胞上液體盡快流盡。加入所用消化酶兩倍體積的預(yù)熱wan全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。輕柔吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使細(xì)胞分散成為單細(xì)胞懸液。

8. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，200g 離心5至10分鐘。

請(qǐng)注意：離心速度和時(shí)間依細(xì)胞種類(lèi)不同而有所差異。

9. 用最少體積的預(yù)熱wan全生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。

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