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克服強(qiáng)樣品溶劑效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)液相色譜可持續(xù)性穩(wěn)定分析
近日，陶氏化學(xué)與安捷倫基于 1290 UHPLC 系統(tǒng)合作開(kāi)發(fā)了一種溶于二氯甲烷（DCM）中且濃度低至 ppb 級(jí)別的雙酚 A 及其二縮水甘油醚衍生物混合物檢測(cè)方法，該套設(shè)備采用了具有 feed 進(jìn)樣模式的 hybrid multisampler，在該進(jìn)樣模式下，樣品以一定的進(jìn)樣速度注入流動(dòng)相中，因此暫時(shí)稀釋樣品，克服了溶劑效應(yīng)，同時(shí)進(jìn)樣量可高達(dá) 45 μL，這種新的進(jìn)樣方法顯著提高了目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)限（>20×）。
消費(fèi)后再生材料（PCR）在消費(fèi)品中的使用正在增長(zhǎng)，而 PCR 必須滿(mǎn)足金屬和有機(jī)成分的法規(guī)要求，或通過(guò)與應(yīng)用相關(guān)的產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。有機(jī)成分通常包括專(zhuān)門(mén)添加的提高產(chǎn)品性能的物質(zhì)（如抗氧化劑）和非添加的物質(zhì)（NIAS），其中非添加物質(zhì)（NIAS）包括了不同來(lái)源的幾類(lèi)有機(jī)物質(zhì)，如污染物和降解物，可能對(duì)人體有害。
針對(duì)高分子量、非揮發(fā)性或者熱不穩(wěn)定的 NIAS，通常使用強(qiáng)溶劑（如二氯甲烷（DCM））提取樹(shù)脂，然后使用反相液相色譜（RPLC）分析。強(qiáng)有機(jī)溶劑在提取塑料材料中 NIAS 時(shí)最具效力，但它們通常對(duì) RPLC 的應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性。因?yàn)?NIAS 的組成可能會(huì)因塑料類(lèi)型和 PCR 的來(lái)源而有很大差異，為了在 PCR 非靶向分析中涵蓋極性、疏水性和官能團(tuán)方面的廣泛有機(jī)分子，通常采用 C8 或 C18 作為固定相，流動(dòng)相會(huì)從高比例水起始，到高比例有機(jī)改性劑（如乙腈或甲醇）結(jié)束來(lái)實(shí)現(xiàn)梯度洗脫，而當(dāng)樣品的溶劑（如二氯甲烷）洗脫強(qiáng)度遠(yuǎn)大于初始流動(dòng)相組成的溶劑洗脫強(qiáng)度時(shí)，會(huì)對(duì)峰寬和峰形產(chǎn)生不利影響，尤其是對(duì)于早洗脫峰而言。
本文選擇 DCM 制備的濃度為 10 ppm 的雙酚 A（BPA）和 6 種雙酚 A 二縮水甘油醚（BADGE）衍生物的混合物作為樣品，首先采用經(jīng)典流通式進(jìn)樣模式，發(fā)現(xiàn)不同進(jìn)樣量和梯度洗脫中等度保持的流動(dòng)相初始比例差異會(huì)帶來(lái)明顯的色譜圖結(jié)果差異，見(jiàn)圖 1。
圖 1.（A）使用 FT 進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣體積為 2 μL 至 10 μL 時(shí)的色譜圖比較。將等度保持設(shè)置為 10% B（深藍(lán)色）或 20% B（淺藍(lán)色）3 min，然后開(kāi)始梯度，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。
實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)典的流通式進(jìn)樣模式下，只有進(jìn)樣量為 2 μL 時(shí)，才能獲得合適的峰形和分離度，結(jié)合使用高靈敏度 DAD 也不能獲得足夠的檢測(cè)限。而在 5 μL 和 10 μL 進(jìn)樣體積下，乙腈濃度從 10% 增加到 20%，各峰形及分離度均不佳，這主要是因?yàn)榉治鑫锶芙庠?DCM 中，進(jìn)樣體積增加，導(dǎo)致分析物在柱頭上的捕獲更不充分，可見(jiàn)進(jìn)樣體積對(duì)分析物聚焦有很大影響。
針對(duì)這類(lèi)樣品，傳統(tǒng)解決溶劑效應(yīng)的方式有：
1、使用較弱的混溶溶劑稀釋樣品溶液；
2、降低進(jìn)樣體積；
3、三明治進(jìn)樣或 co-injection 技術(shù)。
三明治進(jìn)樣或 co-injection 技術(shù)，是在吸樣之前抽取一段水填充 Loop，使樣品通過(guò)低洗脫溶劑聚焦在柱頭上或是使用進(jìn)樣程序?qū)悠放c初始流動(dòng)相混合，從而降低樣品溶劑的整體強(qiáng)度。顯然，這兩個(gè)想法可以結(jié)合起來(lái)，并且可以調(diào)整其中吸入的液體的組成以獲得最佳結(jié)果。遺憾的是，樣品定量環(huán)中需有額外的溶劑填充，而這些進(jìn)樣技術(shù)的最大進(jìn)樣體積有限。以上這些方法即使讓峰形有所改善，也都會(huì)導(dǎo)致方法檢測(cè)限受到影響。當(dāng)然除了以上方法外，若有更合適的溶劑可選，可蒸發(fā)強(qiáng)溶劑并用新的溶劑重新溶解分析物，但其過(guò)程可能很費(fèi)力并且可能造成分析物損失。也有文獻(xiàn)中表示可采用在線固相萃取方式，trap 柱捕獲分析物，隨后在分析色譜柱上進(jìn)行分離，但是這需要更復(fù)雜的儀器硬件和至少兩根填料色譜柱，方法優(yōu)化復(fù)雜，還需考查回收率等。
安捷倫 G7167C hybrid multisampler 除了經(jīng)典流通式進(jìn)樣模式（FT）外，還具有全新的 feed 進(jìn)樣模式（FI）。feed 進(jìn)樣模式可以減少樣品溶劑對(duì)分析物的洗脫，因?yàn)樗沟脴悠啡軇┡c洗脫液在柱前混合，這種短暫的稀釋與初始條件下分析物被色譜柱充分捕獲相結(jié)合，允許我們使用非常強(qiáng)的樣品溶劑，且不會(huì)產(chǎn)生額外的峰展寬或畸變。兩種注射方法的原理如圖 2 所示，在流通式進(jìn)樣時(shí)，通過(guò)切換自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣閥，存儲(chǔ)在自動(dòng)進(jìn)樣器樣品定量環(huán)中的樣品將會(huì)成為流路的一部分，以“液塞”的形式被流動(dòng)相帶入色譜柱。采取 feed 進(jìn)樣模式，樣品會(huì)以一定速率（feed 速度）不斷被打入系統(tǒng)，在 feed 進(jìn)樣期間，液相輸液泵流量會(huì)因有來(lái)自于進(jìn)樣器的流量而減少，從而可以保持總流速不變。
圖 2. 樣品注入原理。(A) 流通式進(jìn)樣 FT；(B) Feed 進(jìn)樣 FI；流動(dòng)相（橙色）的流向?yàn)閺淖笸?，樣品（藍(lán)色）
FEED 進(jìn)樣速度的優(yōu)化
該實(shí)驗(yàn)中，作者對(duì)比了進(jìn)樣器不同設(shè)置下進(jìn)樣 10 μL 樣品所得的色譜圖。在圖 1 中，20% 高乙腈濃度與 FT 注射相結(jié)合時(shí)會(huì)導(dǎo)致所有峰的干擾，但從圖 3 中看到，當(dāng)采用 feed 進(jìn)樣模式，使用 1% feed 速度時(shí)，峰 2-7 峰形及分離度顯著改善。同時(shí)，從圖 3A 可以看出 feed 進(jìn)樣模式下 feed 速度的設(shè)置很關(guān)鍵，會(huì)直接影響色譜分離效果，對(duì)比 10% 乙腈的等度保持分離的色譜圖可以看出，進(jìn)料速度為 10% 的 feed 進(jìn)樣與 FT 進(jìn)樣相比顯然沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。但是隨著 feed 速度從 10% 逐漸調(diào)整到 0.5% 時(shí)，化合物 2 的峰寬降低至 0.113 分鐘，同時(shí)，峰對(duì)（峰 3 和 4）和三重峰（峰 5-7）的分辨率顯著提高，如圖 3B 所示。進(jìn)料速度從 1% 降低到 0.5% 僅顯示出輕微的改善，同時(shí)注射持續(xù)時(shí)間加倍。因此，當(dāng)進(jìn)料速度為 1% 且在 10% 乙腈下保持等度時(shí)，可獲得最佳結(jié)果。
圖 3.（A）不同進(jìn)樣模式對(duì)分離性能的影響。在 10 μL 進(jìn)樣體積下，比較 FT 進(jìn)樣與 0.5-10% feed 速度下 FI 所得色譜圖。10 % B（暗跡線）或 20 % B（亮跡線）的等度保持設(shè)置為 3 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。
等度保留時(shí)間的優(yōu)化
如上所述，F(xiàn)I 應(yīng)與足夠的捕獲條件相結(jié)合。需要考慮的另一點(diǎn)是梯度開(kāi)始之前的等度保持持續(xù)時(shí)間。持續(xù)時(shí)間取決于進(jìn)樣量、recondition 溶劑量和 feed 速度，而 feed 速度又取決于 HPLC 泵的流速。為了減少等度保持持續(xù)時(shí)間并進(jìn)而縮短分析持續(xù)時(shí)間，最好選擇最高的進(jìn)料速度，同時(shí)保持所需的分離性能。當(dāng)液相泵的流速為 1.5 mL/min，20 μL 進(jìn)樣量下，進(jìn)料速度為 1% 時(shí)，進(jìn)樣時(shí)間為 1.3 分鐘。但對(duì)比圖 4 中 2-4 min 的等度保持時(shí)間下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)等度保留 2 min 時(shí)保留時(shí)間最短的化合物（峰 1）的峰不僅顯著變寬，而且相對(duì)于調(diào)整的時(shí)間軸提前 0.64 分鐘洗脫。為了揭示這種行為的原因，運(yùn)行了 DCM 溶劑空白（圖 4B 中的淺色軌跡），發(fā)現(xiàn) 2 min 等度保持時(shí)間下，DCM 與峰 1 共洗脫，很明顯，DCM 也保留在色譜柱上，因?yàn)槠浞宓那把仉S著等度保持時(shí)間的增加而延遲，因此等度保持時(shí)間要足夠長(zhǎng)，只有這樣才能將 DCM 與目標(biāo)分析物分離。等度保持時(shí)間延長(zhǎng)，梯度變化引起的基線下降與 DCM 峰前沿越來(lái)越近，這也很好說(shuō)明了這一點(diǎn)。
圖 4. (A) 不同等度保持時(shí)間（圖中所示）對(duì) 1% 進(jìn)料速度（Vinj = 20 μL）FI 分離性能的影響。此外，還顯示了 5 μL FT 進(jìn)樣的 4 倍信號(hào)放大圖。每個(gè)樣品溶液色譜圖（深色）都疊加了 DCM-空白（淺色）。在 276 nm 處記錄 UV 吸收。(B) 227 nm 的波長(zhǎng)下，并且未應(yīng)用時(shí)間軸調(diào)整或放大，其他條件與 (A) 相同。
提高進(jìn)樣量
當(dāng)進(jìn)樣速度為 1% 時(shí)，自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣體積最大為 45 μL，無(wú)需手動(dòng)調(diào)節(jié) recondition 溶劑體積。圖 5 比較了 feed 進(jìn)樣（45 μL）和 FT 進(jìn)樣（5 μL）下的色譜圖，對(duì)于關(guān)鍵峰對(duì)（峰 3 和 4）的分辨率，F(xiàn)I 顯示為 1.48，而 5 μL FT 注射產(chǎn)生的分辨率僅為 1.18。而將 feed 進(jìn)樣（45 μL）與 FT（2 μL）進(jìn)樣色譜圖進(jìn)行比較，在幾乎相同的分辨率下，F(xiàn)I 的注射量提高了 22.5 倍，也就是靈敏度可以提高 20 倍以上，這是一個(gè)實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)。在該優(yōu)化條件下，根據(jù) 10 ppm 樣品溶液峰高響應(yīng)及噪聲來(lái)粗略地估算檢測(cè)限，檢測(cè)限（LOD）范圍在 1-10 ppb 之間。
圖 5. 1% feed 速度下 FI 最大進(jìn)樣量（Vinj = 45 μL）和 FT 進(jìn)樣（Vinj = 5 μL）的色譜圖的比較。10% 乙腈等度保持 2 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。
在本研究中，作者通過(guò) RPLC 和 UV 檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了 DCM 中雙酚 A（BPA）和雙酚 A 二縮水甘油醚（BADGE）衍生物的大體積進(jìn)樣和分離。最初，經(jīng)典流通式進(jìn)樣模式下，只有注射量為 2 μL 時(shí)才有可能獲得合適的峰形和分辨率，而通過(guò) hybrid multisampler 中新的 FI 的進(jìn)樣模式，既克服了強(qiáng)溶劑效應(yīng)，還可繼續(xù)增大進(jìn)樣量，從而極大提升了方法靈敏度。總體而言，F(xiàn)I 在受“強(qiáng)溶劑效應(yīng)”影響的各種應(yīng)用中具有很高的痕量分析潛力。