時間分辨熒光免疫分析原理

熒光法是一種非常有用的工具，各種各樣的分析領(lǐng)域都在利用它。由于它具有高靈敏度、好的選擇性以及可提供多參數(shù)信息（如，熒光強度、熒光壽命、熒光各向異性）等特點，所以被廣泛用于生物制藥研究、臨床診斷、宇宙空間環(huán)境監(jiān)測、免疫分析中分子間作用原理研究、DNA序列分析、熒光原位雜交以及細胞成分分析等。鑭系系復合物由于其*的熒光特性，而受到廣泛關(guān)注，特別是在臨床生化分析中。利用鑭系元素的熒光特性，構(gòu)建時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）試劑以及創(chuàng)建新的靈敏度高的熒光免疫分析方法（fluoroimmunoassay）是當今臨床生化的主要研究方向。

1、熒光基本原理：

化學體系的光致發(fā)光提出較早，光致發(fā)光有兩種常見的類型熒光和磷光，它們都是化學體系被電磁輻射所激發(fā)，然后發(fā)射出相同或較長波長的輻射。其中磷光，從分析角度看，意義不是很大。熒光由于其固有的靈敏性而受到人們的偏愛。

熒光標記方法的檢出限可達10-15～10-18水平。簡單和復雜的氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)化學體系均可發(fā)熒光。簡單的熒光有稀的原子蒸氣發(fā)出，經(jīng)過10-8秒后電子回到基態(tài)同時發(fā)出兩種相同的輻射，這稱為共振熒光。有些物質(zhì)受激后發(fā)射出波長較長的特征輻射，這種現(xiàn)象叫Strokes位移。熒光現(xiàn)象只限于相當少數(shù)其結(jié)構(gòu)和環(huán)境特點使其*弛豫或活化過程的速率減慢到發(fā)射反應可在動力學上與其相匹配程度的體系。

熒光發(fā)射又稱為去活化過程，它受發(fā)射速率和振動弛豫影響。熒光發(fā)射是激發(fā)過程的逆過程，所以受激態(tài)壽命和對應于激發(fā)過程的吸收峰的摩爾吸收系數(shù)之間存在一個倒數(shù)關(guān)系，實驗證明摩爾吸收系數(shù)在103～105時，熒光去活化的壽命為10-7～10-9秒。

振動弛豫即在電子激發(fā)過程中分子可被激發(fā)到任何振動能級，但在溶液中，過量的振動能量會由于受激組分的分子與溶劑分子間的碰撞而馬上消失，結(jié)果能量轉(zhuǎn)移只是使溶劑的溫度有一個微小的改變。影響熒光的因素有量子產(chǎn)率、熒光躍遷類型、熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、溶液的溫度和溶劑效應、溶液的PH值以及溶解氧的含量等。量子產(chǎn)率是發(fā)射熒光分子的數(shù)目與受激態(tài)分子總數(shù)之比。

熒光躍遷類型指鍵的躍遷，一般σ*—σ躍遷產(chǎn)生熒光很少見，表現(xiàn)為熒光很少由吸收波長小于205nm的紫外輻射引起，而主要限于π*—π、π*—η躍遷。一般含有芳香官能團的化合物發(fā)射熒光強度大，簡單的雜環(huán)化合物如吡啶、呋喃和吡咯等不發(fā)射熒光，稠環(huán)化合物一般發(fā)射熒光。實驗發(fā)現(xiàn)剛性結(jié)構(gòu)的分子容易發(fā)射熒光，同時有機絡合劑與金屬離子形成絡合物使發(fā)射熒光增強。大多數(shù)熒光效率會隨溫度增加而增加。溶劑的極性對熒光強度也有影響，一般成正比關(guān)系。

PH對熒光有較大的影響，一般因物質(zhì)而異，所以熒光為基礎(chǔ)的分析需要嚴格控制PH值。溶解氧的存在可使熒光強度降低。常見的熒光素發(fā)射熒光由由以下幾個過程的綜合結(jié)果（見圖1.1以Eu3+為例）。在外激發(fā)階段，熒光團吸收外激發(fā)光所提供的能量，由于分子振動，使熒光團從基態(tài)（S0）躍遷到激發(fā)態(tài)。在這種狀態(tài)下，大部分熒光團迅速釋放能量，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換（非放射衰減）轉(zhuǎn)變?yōu)?span id="xnpwiyv" class="bjFfcClass">低的振動水平S1，這個過程產(chǎn)生熒光發(fā)射譜。

時間分辨熒光免疫分析原理

杭州柏納科技歡迎您 

華東區(qū)實驗室專業(yè)儀器設(shè)備集成供應商