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名稱：轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立(SOP)

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因小鼠

目的：在動(dòng)物體研究轉(zhuǎn)化基因

原理：

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指染色體基因組中整合有外源基因并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。整合到動(dòng)物染色體基因組的外源基因稱為轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因技術(shù)則是指制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所需的一套技術(shù)，它涉及外源基因的構(gòu)建、載體和受體的篩選、基因?qū)思夹g(shù)、供轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物等許多方面。

當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，外源基因可能只整合到動(dòng)物的部分組織細(xì)胞的基因組，也可能整合進(jìn)動(dòng)物所有組織細(xì)胞的基因組中。部分組織細(xì)胞的基因組中整合有外源基因的動(dòng)物，稱為嵌合體動(dòng)物。此類動(dòng)物中，只有外源基因整合的“部分組織細(xì)胞”恰為生殖細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)基因才具有遺傳性狀，否則，外源基因?qū)⒉荒軅鹘o子代。

轉(zhuǎn)基因的方法多樣，有胚胎干細(xì)胞法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法，顯微注射法等，此章介紹顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。此法獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的數(shù)量較多。

（一）顯微注射法的基本原理和方法

轉(zhuǎn)基因小鼠制備的基本原理是將改建后的目的基因(或基因組片段)用顯微注射法注入供體小鼠的受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)，然后將此受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)再植入受體動(dòng)物的輸卵管(或子宮)中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因和實(shí)驗(yàn)小鼠表型的關(guān)系，研究揭示外源基因的功能，而且可進(jìn)行工程動(dòng)物的大量生產(chǎn)。

Gorden等報(bào)道了顯微注射法用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。本法是早，且應(yīng)用成功率較高的一種轉(zhuǎn)基因方法。其基本步驟如下：

1．同步獲得供體雌鼠（注射激素的雌鼠與正常雄鼠交配而得）和假孕受體母鼠（正常雌鼠與結(jié)扎雄鼠交配產(chǎn)生)。

2．供體鼠注射絨毛膜促性腺激素后，采集清晰的原核受精卵。

3. 用顯微注射法將純化的外源基因注射進(jìn)受精卵的原核內(nèi)。

4. 受精卵鑒定 ，將存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的輸

卵管(或子宮)內(nèi)，飼養(yǎng)后鑒定是否受孕以及個(gè)體發(fā)育狀況。

5. 子代鼠外源基因整合和表達(dá)的檢測(cè)。

6. 轉(zhuǎn)基因小鼠品系的建立。

[優(yōu)點(diǎn)]

（1）外源基因在宿主染色體上的整合率相對(duì)較高；

（2）此法導(dǎo)入外源基因無(wú)需載體；

（3）轉(zhuǎn)基因小鼠得率在60%-80%；

（4）導(dǎo)入的外源基因可長(zhǎng)達(dá)50kb。[不足之處]

（1）外源基因隨機(jī)整合；

（2）個(gè)別原核不清晰，需進(jìn)行特殊處理；

（3）需大型精密儀器，費(fèi)用昂貴；

（4）操作周期相對(duì)較長(zhǎng)。

（二）實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備

1．輸精管切除術(shù)用器材：彎式有齒鑷、直式有齒鑷、顯微鑷、手術(shù)剪、自動(dòng)小

夾涂藥器、自動(dòng)小夾、帶彎針4/0絲線及持針器、直徑為10cm塑料 Petri氏

培養(yǎng)皿（內(nèi)盛70%乙醇）。

2．手術(shù)前麻醉

2，2，2 三溴乙醇（阿佛?。┦窍喈?dāng)有效的麻醉劑。因該試劑對(duì)光敏感，所以應(yīng)該于4度避光保存，新試劑用前應(yīng)進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后，為了使麻醉劑盡快發(fā)生作用，將小鼠放回原籠熟悉的環(huán)境中，小鼠將會(huì)更容易松馳下來(lái)。 擠壓小鼠腳墊，如果小鼠能感覺到此刺激，小鼠將從擠壓部位開始縮腿運(yùn)動(dòng)（pedal reflex），用此方法可以檢察是否麻醉*。實(shí)驗(yàn)中小鼠無(wú)縮腿運(yùn)動(dòng)、小鼠達(dá)到手術(shù)所需的麻醉深度以及程度方可開始手術(shù)。

三溴乙醇的反復(fù)使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎癥反應(yīng)。其他麻醉劑中，克他命/甲苯噻嗪在獸醫(yī)界廣泛應(yīng)用，另外，克他命/美托咪定也越來(lái)越受到青睞，特別是在美國(guó)。我國(guó)一些實(shí)驗(yàn)室用戊鈉的效果好,特別是尾靜脈注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊鈉0.3ml左右。

3．受精卵的采集用器材：70%乙醇、手術(shù)剪、10mL解剖剪、手術(shù)鑷、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等。

4．離體輸卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科鑷子、5號(hào)鑷子、

無(wú)菌30-mm組織培養(yǎng)皿、解剖顯微鏡、透明質(zhì)酸酶、移液管、工作液、M16溶液（Sigma）、3ml注射器等。

5．DNA顯微注射用器材

（1） 受精卵的收集與移動(dòng)用器材：巴氏移液管、酒精燈、特制吸管、玻璃刀等。

（2） 凹玻片準(zhǔn)備：一塊標(biāo)準(zhǔn)的凹型載玻片（硅化）、礦物油（Sigma）、工作液等。

（3） 注射設(shè)備的設(shè)置：微型水力驅(qū)動(dòng)設(shè)備、Hamilton Gas-Tite?注射器（250 ?l）、

Intramedic?管道系統(tǒng)（外徑1.27mm，內(nèi)徑0.86mm）、兩只玻璃管道連接頭、三通管連接器、一只帶接頭的60ml塑料注射器、一只器械套管、礦物油等。

（4）受精卵的顯微注射用器材：凹玻片（顯微注射用）、倒置立體相差顯微鏡

或倒置Nomarski立體光學(xué)顯微鏡、顯微操縱器、千分尺（連接添滿礦物油，且耐氣構(gòu)造的250?l漢密爾頓注射器）、氣壓裝置(50ml充滿氣體的注射器) 、持卵管、預(yù)載DNA的注射針等。

6．輸卵管轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)備

（1） 手術(shù)試劑器材：麻醉劑（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇、一副鈍性齒鑷、兩副5號(hào)精細(xì)鑷子、一副10cm手術(shù)剪、帶自動(dòng)小夾的金屬大剪、一個(gè)小彈簧夾、外科縫線、解剖顯微鏡、纖維光學(xué)照明器、載針頭的1ml注射器、kimwipe綿紙或外科紗布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手動(dòng)移卵管等。所有的手術(shù)器械在使用前應(yīng)該*清洗，70%乙醇消毒或高熱滅菌處理。2）受體母鼠的準(zhǔn)備

輸卵管轉(zhuǎn)移的受體鼠應(yīng)該為4-6周齡大小，體重在20-25克左右，嚴(yán)禁用低體重以及超重母鼠，若體重較低，其體能不足以維持妊娠，可能導(dǎo)致受精卵的重新吸收；若體重較重，麻醉劑被吸收入脂肪組織，降低麻醉效果，可能使手術(shù)困難，而且脂肪組織的存在意味著靜脈的存在，所以手術(shù)時(shí)切掉脂肪組織可能導(dǎo)致不必要的出血，難以確認(rèn)手術(shù)時(shí)的操作對(duì)象。出血也可能堵塞移卵管。選擇輸卵管轉(zhuǎn)移前一天晚上與切除輸精管小鼠交配的假孕母鼠，注射當(dāng)天早上母鼠可見精栓。盡管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，隨著體重的增加，它們將表現(xiàn)出不同程度的感覺消失，但它們是優(yōu)良的哺育母鼠。另外，它們的價(jià)格也便宜。另一個(gè)成功的鼠系是B6D2F1，它們生命力強(qiáng)并有一定雜合優(yōu)勢(shì)。

（3）麻醉劑：阿佛丁被證明是輸卵管轉(zhuǎn)移手術(shù)的有效麻醉劑。

（三）實(shí)驗(yàn)操作程序和方法

1．鼠系克隆

（1） 動(dòng)情期的探測(cè)：在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立中母鼠動(dòng)情期的監(jiān)測(cè)有很高的技巧性。小鼠的動(dòng)情期主要?jiǎng)澐譃樗膫€(gè)時(shí)期：

① 動(dòng)情后期：陰道口無(wú)擴(kuò)張，周圍組織為灰白色，陰道口周圍無(wú)膨大

② 間情期：陰道開口小，周圍組織為灰色或藍(lán)色。

③ 動(dòng)情前期：陰道口逐漸擴(kuò)張，陰道周圍組織由粉紅色變?yōu)榧t色。

④ 動(dòng)情期：陰道周圍組織顏色由紅色轉(zhuǎn)為粉紅色，陰道口背側(cè)唇可見條

紋，陰道口腹側(cè)唇可見腫大，陰道有分泌液外滲。

隨機(jī)選擇動(dòng)物，任何時(shí)間都可能有20%-25%的動(dòng)物處于動(dòng)情期。大多鼠科動(dòng)物的動(dòng)情期平均持續(xù)4-5天，所以對(duì)群居性動(dòng)物的個(gè)體進(jìn)行動(dòng)情周期的同步化處理后可能在任一時(shí)期產(chǎn)生大量發(fā)情動(dòng)物。動(dòng)情期動(dòng)物的選擇需兩個(gè)指標(biāo)：陰道周圍組織色澤和組織膨脹的程度。動(dòng)情期動(dòng)物陰道組織深粉紅色，但并不同于炎癥時(shí)的色澤。另外，陰道口周圍背腹部組織腫脹而有光澤，起初其腹部可見條紋。個(gè)別陰道口組織色澤較深，但無(wú)膨脹，或陰道口稍微擴(kuò)大且略帶灰色者為非動(dòng)情期動(dòng)物，切勿誤選它們用于交配。

（2）交配的確認(rèn)：陰栓形成。動(dòng)物合籠后，確定雄性個(gè)體是否與母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在陰道內(nèi)凝固成柔軟栓性物，成功交配后不久有陰道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根處，使小鼠頭部向下，仔細(xì)觀察陰道口部位，交配過(guò)的雌性小鼠可見有白色橡皮擦狀的陰道栓，易肉眼所見，難以確定時(shí)可用小探針檢查陰道深部是否有栓子存在。檢查陰栓應(yīng)在每天早上的早些時(shí)間，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，陰栓將被排出體外。

2．輸精管切除術(shù)：輸精管切除小鼠用于與晶胚轉(zhuǎn)移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周齡進(jìn)行輸精管切除術(shù)，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。阿佛丁腹腔注射麻醉劑量為240mg/kg。

（1）  稱重后麻醉小鼠，背位固定小鼠，大剪刀貼近皮膚剪毛，70%的乙醇涂 搽消毒手術(shù)切口部位，以防止毛發(fā)污染切口。

（2）  于生殖器前方大約1.3cm處橫行剪開下腹部皮膚，作約1cm的切口，

用浸70%乙醇的紗布搽拭切口部位以清理毛發(fā)。

（3）  切開腹膜，進(jìn)行膀胱定位。每側(cè)都可見有一條管道走行，用鑷子輕輕夾

持左側(cè)管道，提起部分使手術(shù)視野清晰可見，確定其為輸精管。

（4）  將鑷子插進(jìn)輸精管下方，使它們處于自然狀態(tài)，其末端垂直。同時(shí)在該

位置兩端用縫線結(jié)扎輸精管，距離大約4-5毫米。在兩結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸精管，置其于紗布上確定此側(cè)手術(shù)完畢。

（5）  將輸精管兩個(gè)斷端輕輕放回腹腔，如上處理右側(cè)輸精管。兩側(cè)手術(shù)完畢后，2-3根單獨(dú)縫線縫合腹壁切口。待用縫線須浸泡在70%乙醇中，保持縫線濕潤(rùn)，防止結(jié)扎時(shí)粘附組織。用兩個(gè)或三個(gè)自動(dòng)小夾夾閉皮膚。（6）  為保暖包裹小鼠于紗布中或?qū)⑵浞胖糜跓釅|內(nèi)使其蘇醒，處于麻醉狀態(tài)

下的小鼠應(yīng)該嚴(yán)格監(jiān)護(hù)直到其*蘇醒。手術(shù)后小鼠飼養(yǎng)2周后確定手術(shù)是否成功。

（7） 實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)：將1-2只母鼠與輸精管切除小鼠合籠飼養(yǎng)，次晨進(jìn)行陰道栓檢查。有陰道栓的母鼠，用磷酸緩沖液處理后24小時(shí)，其輸卵管潮紅。卵細(xì)胞應(yīng)該處于單細(xì)胞期或未受孕狀態(tài)，若處于雙細(xì)胞期，則輸精管切除未*，雄性小鼠應(yīng)進(jìn)行再篩選。

3．受精卵的收集

（1）受精卵的采集：受精卵獲得的方法分自然排卵和激素誘發(fā)排卵以及體外受精三種方法。本章對(duì)誘發(fā)排卵法給予介紹。

誘發(fā)排卵法：雌性小鼠生后6—8周達(dá)到性成熟，性周期均為4—5 日，其排卵時(shí)間可用飼養(yǎng)室的明亮和黑暗進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以必須對(duì)飼養(yǎng)室的明暗規(guī)律進(jìn)行準(zhǔn)確嚴(yán)格地管理。

性周期是卵泡刺激素和黃體生成素相互作用的結(jié)果，我們可以從外部給予這些激素誘發(fā)排卵。向成熟雌小鼠腹腔內(nèi)注射5單位(IU)的孕馬血清促性腺激素(PMSG)之后，約在48—54h后再將2.5-5.0 IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔內(nèi)，約12h后即可誘發(fā)排卵。排卵數(shù)量可達(dá)自然排卵的2倍，效果很好。雌小鼠給予hCG后應(yīng)立刻與雄性合籠。成熟雄小鼠應(yīng)按每籠飼養(yǎng)1只，雄性小鼠大小在12周齡到1年。合籠時(shí)，須將激素化雌性小鼠放進(jìn)雄小鼠的籠中。雄小鼠釋放促雌性發(fā)情的外激素，在交配過(guò)程中建議不換籠，交配過(guò)的雄小鼠，間隔一周后才進(jìn)行下次交配。

顯微注射的受精卵于交配后次晨注射前幾小時(shí)收集，此時(shí)易進(jìn)行注射操作。交配后過(guò)夜小鼠的陰道栓易見，可用交配指示劑指示。對(duì)超排卵的交配母鼠體內(nèi)進(jìn)行陰道栓計(jì)數(shù)一般正常。低比率的有栓母鼠說(shuō)明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配過(guò)度或雄性小鼠老齡化。收獲受精卵必須打開小鼠腹腔，輸卵管必須仔細(xì)切開。輸卵管沖洗術(shù)或輸卵管壺部切開術(shù)都可作為收集受精卵的方法。

（2）腹腔內(nèi)輸卵管的切開

1） 通過(guò)斷頸或二氧化碳吸入快速處死小鼠。

2） 將動(dòng)物背位固定在無(wú)菌干燥的吸水紙上，剪毛并用70%的乙醇*涂搽手術(shù)部位。以避免毛發(fā)污染手術(shù)視野。

3） 持眼科鑷捏緊下腹部正中線皮膚，用外科剪作小的橫切口，剪刀鈍性分離充分暴露手術(shù)視野，或鈍性撕開皮膚暴露腹膜。用眼科剪打開腹膜，充分暴露腹腔與子宮角部手術(shù)視野。子宮為Y形，為起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支為兩側(cè)子宮角，向上橫行深入腹腔。

4） 用鑷子距輸卵管卵巢6-7mm處夾持子宮角翻轉(zhuǎn)后輕輕拖出腹腔，在鑷子捏點(diǎn)下部子宮角下方附近刺破腸系膜，清除腸系膜組織遠(yuǎn)離子宮角與輸卵管，并防止用力過(guò)大壓破子宮角與輸卵管連接處。

5） 用鑷子拖出脂肪墊，卵巢，輸卵管以及子宮部件。小心剪掉卵巢與輸卵管之間的薄層膜，然后剪下輸卵管和部分子宮角，將其盛放在盛工作液的小玻璃皿中，對(duì)另一側(cè)輸卵管重復(fù)上面操作，完畢后如上處理下一只動(dòng)物。

（3）離體輸卵管內(nèi)受精卵的收集：解剖鏡下觀察近輸卵管漏斗部上部明顯潮紅此為壺腹部。用眼科鑷子撕開膨大的壺腹部即看到包繞受精卵的丘細(xì)胞團(tuán)。

1）轉(zhuǎn)移輸卵管于含工作液的小玻璃皿中。

2）眼科鑷子夾持壺腹部，并用另一只眼科鑷子撕開膨大的輸卵管，游離的受精卵慢慢流出，也可以用鑷子輕輕擠壓輸卵管將受精卵推出裂口。

（4）透明質(zhì)酸酶處理與受精卵的漂洗

工作液中受精卵可能成團(tuán)狀，微注射用的受精卵必須是單個(gè)細(xì)胞，而且無(wú)細(xì)胞碎片。漂洗細(xì)胞時(shí)，首先用工作液除去細(xì)胞碎片。不成團(tuán)細(xì)胞可用無(wú)菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中，注意把握移液管的張力。溶解在工作液中的透明質(zhì)酸酶對(duì)細(xì)胞團(tuán)以及復(fù)合體進(jìn)行消化時(shí)必須嚴(yán)密觀察，一旦細(xì)胞團(tuán)溶解立即將單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮工作液中，防止消化過(guò)度。

用工作液漂洗2-3次，清除碎片后，用無(wú)菌移液管將受精卵置于特殊培養(yǎng)基（M16），放于37?C, 5% CO2孵箱中待注射，此培養(yǎng)基上層覆蓋高壓消毒礦物油，可防止污染同時(shí)防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)影響pH。受精卵在體外發(fā)育較體內(nèi)快，在孵育過(guò)程中注意觀察一些受精卵清晰可見原核形成，在此期間可先選出原核清晰的卵(形態(tài)稍不規(guī)則)用于注射，其它卵繼續(xù)培養(yǎng)。注射后，再篩選，再注射，直至得到滿意的注射卵數(shù)。