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基因型

F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10 trxB (KanR,TetR) pLysS CamR

簡(jiǎn)要說(shuō)明

Origami B (DE3) pLysS菌株攜帶pLysS質(zhì)粒，具有l(wèi)u霉素抗性。pLysS可表達(dá)T7yu菌酶（T7 yu菌酶可以作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，還可與T7RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)），適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。Origami B (DE3) pLysS菌株表達(dá)突變的硫氧還蛋白還原酶 (thioredoxin reductase) (trxB)和gu胱甘肽還原酶(glutathione reductase) (gor)，這兩個(gè)酶是還原途徑的關(guān)鍵酶，突變后有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。此外，該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)(DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，具有l(wèi)u霉素、ka那霉素和四環(huán)素抗性，不能用于具有l(wèi)u霉素，ka那霉素抗性質(zhì)粒的表達(dá)。Origami B (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)108 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明

1、取100μl冰上融化的Origami B (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

 3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、取100μl冰上融化的Origami B (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。