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脂質(zhì)-配體相互作用工具:脂質(zhì)不再是可怕的中間體
閱讀：1367 發(fā)布時(shí)間：2023-9-8
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當(dāng)細(xì)胞生物學(xué)家第一次發(fā)現(xiàn)可能有一種脂質(zhì)參與他們最喜歡的途徑時(shí)，這有點(diǎn)像在馬路對(duì)面找到一堵墻(就像當(dāng)脂質(zhì)學(xué)家在他們的路上找到一種蛋白質(zhì)一樣……)。
由于脂質(zhì)的不同性質(zhì)，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)家都害怕在他們的研究過程中不得不面對(duì)這種情況。好消息是，有一些簡(jiǎn)單的方法可以幫助克服這一障礙，使研究特定途徑中的脂質(zhì)變得更容易。在這里，我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準(zhǔn)備工具。
1 覆蓋試驗(yàn)Overlay assays-鑒定與給定蛋白質(zhì)相互作用的脂質(zhì)
這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質(zhì)與給定蛋白質(zhì)相互作用。
與Western-blot原理類似，它們的原理是在表面涂上各種類型的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)將與已知的蛋白質(zhì)接觸，這種蛋白質(zhì)將被標(biāo)記或抗體臨時(shí)檢測(cè)到。脂質(zhì)的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點(diǎn)印跡法一樣，需要優(yōu)化一些實(shí)驗(yàn)參數(shù)(如緩沖液、蛋白質(zhì)純化或蛋白質(zhì)濃度)。
當(dāng)可用蛋白質(zhì)的數(shù)量有，小的“覆蓋分析格式"可以用少于0.5 mg的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。這是一種簡(jiǎn)單的方法來測(cè)試一種感興趣的蛋白質(zhì)對(duì)各種脂質(zhì)的結(jié)合能力!
為了檢查蛋白質(zhì)對(duì)各種類型的脂質(zhì)的相對(duì)親和力，硝基纖維素陣列被標(biāo)記為每種脂質(zhì)的梯度。幾個(gè)相同的陣列可以證明在測(cè)試單特異性或多特異性蛋白質(zhì)有用。該技術(shù)顯示出高特異性(圖2)，結(jié)果甚至比ELISA試劑盒更干凈，再次強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的必要性。
對(duì)于那些對(duì)膜不熟悉的人，或者正在研究大量蛋白質(zhì)的人，也可以使用聚苯乙烯板，用各種類型的脂質(zhì)共價(jià)涂覆(稱為COVA板)。用于高含量篩選的微陣列板格式允許您在單個(gè)板上測(cè)試具有不同脂質(zhì)的幾種蛋白質(zhì)(親和性)。平板的每孔都有9種不同的脂質(zhì)，用于檢測(cè)先前標(biāo)記或通過免疫檢測(cè)的蛋白質(zhì)。圖3所示的是一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(已知與兩種不同的脂質(zhì)相互作用)。對(duì)于前面介紹的設(shè)置，需要優(yōu)化蛋白質(zhì)濃度。
2 下拉試驗(yàn)Pull-down assays-發(fā)現(xiàn)一種已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伙伴
對(duì)于相反的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，當(dāng)您想要識(shí)別已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伴侶時(shí)，瓊脂糖為基礎(chǔ)的下拉試驗(yàn)等制備技術(shù)將是您的選擇:
*瓊脂糖珠包被確定的脂質(zhì)可以被進(jìn)一步孵育與細(xì)胞裂解液，上清液，重組蛋白…
* 然后相互作用的復(fù)合體通過離心將它們拉下來。
它允許分離脂質(zhì)結(jié)合蛋白的數(shù)量適合進(jìn)一步鑒定和表征。它經(jīng)常與細(xì)胞裂解液一起用于“撈出"脂質(zhì)對(duì)偶物(圖4)。
3 漂浮試驗(yàn)Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用
當(dāng)你在尋找更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用時(shí)，另一種基于脂質(zhì)富集脂質(zhì)體(用作脂質(zhì)/配體相互作用的基質(zhì)支持)的制備方法是可用的。
與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類似，脂質(zhì)體預(yù)結(jié)合到脂質(zhì)配體上，將沿著超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個(gè)部分分布(圖5)。
這些富脂脂質(zhì)體有許多優(yōu)點(diǎn):
*聚脂質(zhì)體PolyPIPosomes是聚合的脂質(zhì)體，
*增加穩(wěn)定性(長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月)，
*生物素標(biāo)簽，方便鏈霉親和素檢測(cè)，
*尺寸均勻(~200 nm)，可進(jìn)行浮選試驗(yàn)，
*這些脂質(zhì)體也可用于:表面等離子體共振，脂質(zhì)體覆蓋分析，ITC。
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