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目的
學(xué)習(xí)并掌握觀察人正常組織來源細(xì)胞和根霉形態(tài)特征的基本方法。
原理
毛霉和根霉都屬于真菌的接合菌門。它們是空氣中zui常見的污染菌。菌落生長迅速，表面呈棉花樣，初為白色，以后變灰至褐灰色。菌絲單細(xì)胞無橫隔，有分枝，多核。毛霉無假根；根霉有假根和匍匐絲。無性生殖產(chǎn)生孢囊孢子。孢囊梗直接由菌絲體上長出，孢囊梗頂端膨大形成孢囊，孢囊成熟破裂后，露出囊軸，囊軸基部與孢囊梗連接處稱為囊托。毛霉無囊托，根霉的假根上方產(chǎn)生孢囊梗。孢囊孢子呈球形、卵形或不規(guī)則形。有性生殖形成接合孢子，常為異宗配合即由“+"“－"型菌絲接合形成。這些結(jié)構(gòu)均可通過制水壓片在低倍鏡下進行觀察。
很多青霉、曲霉及鐮刀菌尚未發(fā)現(xiàn)它們的有性生殖階段，常稱為半知菌。 即只知其生活周期的一半。目前已發(fā)現(xiàn)有些菌的有性階段屬于子囊菌或擔(dān)子菌。這三種菌的無性生殖階段均有特征性的分生孢子梗及分生孢子形態(tài)和分生孢子著生方式。它們多是腐生菌，廣泛分布于土壤、空氣、水果和糧食中。青霉菌落多為灰綠色，菌落質(zhì)地絨狀、絮狀、繩狀或束狀，成熟后表面呈粉末狀。青霉菌絲可直接分化形成分生孢子梗，其頂端具有對稱或不對稱的掃帚狀分枝，其上著生幾輪小梗，小梗頂端著生成串的球狀或卵狀的綠色分生孢子。曲霉菌落呈絨毛狀或絮狀，表面有同心圓形的輪狀帶。分生孢子梗長在厚壁的足細(xì)胞上，不分枝，頂端膨大成球形、橢圓形或棍棒狀頂囊。其表面著生一層或兩層小梗，下層為柱狀初生小梗，上層為瓶狀次生小梗，頂端著生成串的球狀分生孢子。鐮刀菌菌落呈絨毛狀，多為白色、粉紅色或紫紅色。菌絲分隔有分枝。具有兩種分生孢子，小型分生孢子梗分枝或不分枝，其頂端有鏈狀或假頭狀著生的小型分生孢子。大型分生孢子梗不分枝，其頂端著生鐮刀狀大型分生孢子，多隔，單生或叢生。
載片培養(yǎng)法是研究絲狀真菌生長繁殖全過的有效方法。即將菌絲體接種在載玻片上的小塊培養(yǎng)基薄片上，加蓋蓋玻片，使絲狀真菌只能在載玻片和蓋玻片的狹窄空間內(nèi)橫向生長，因而可觀察到孢子萌發(fā)、菌絲生長及孢子形成的各生長階段，且不會因觀察而污染標(biāo)本片。
材料
1．菌種：毛霉（Mucor）“+"、“－"型菌株
根霉（Rhizopus）
青霉（Penicillium sp.）
曲霉（Aspergillus sp.）
鐮刀菌（Fusarium sp.）
2．浮載劑：乳酸酚溶液。
3．培養(yǎng)基：真菌培養(yǎng)基。
4．其它：無菌培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，無菌水，擦鏡紙，吸水紙及接種鉤。
方法
1．形態(tài)觀察
（1）直接觀察：不打開培養(yǎng)皿蓋，將培養(yǎng)皿置于載物臺上，在低倍鏡下直接觀察毛霉和根霉的各部分結(jié)構(gòu)。
（2）制水壓片：取一潔凈載玻片，于中央滴1 滴乳酸酚溶液，用接種針挑取少許菌絲及孢囊于染液中，用兩根接種針將其拉松散，再輕輕蓋上蓋玻片。注意：千萬不要有氣泡！置于高倍鏡下進行觀察。
2．毛霉接合孢子觀察
（1）培養(yǎng)：分別在已倒好馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的平皿背面中央劃一條線，于線左右分別標(biāo)“－"“+"， 然后取相應(yīng)的毛霉菌株接種，并在26℃ 恒溫箱中倒置培養(yǎng)7 天。
（2）鏡檢：在低倍鏡下沿劃線處尋找接合孢子，在顯微鏡下直接觀察，或制成水壓片進行觀察。
3．載片培養(yǎng)法觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)
（1）準(zhǔn)備材料：在培養(yǎng)皿內(nèi)放1 張圓形濾紙片，1 個U 型架，1 片載玻片和2 片蓋玻片，滅菌后備用；
（2）制薄層培養(yǎng)基：取一平底無菌培養(yǎng)皿，向內(nèi)倒入約5ml 已融化馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，迅速搖勻使成薄層。凝固后，用無菌解剖刀割為1cm2 小塊；
（3）制片：在無菌操作下，向U 型棒支撐的載玻片上移入2 小塊培養(yǎng)基，在中央分別接種青霉、曲霉和鐮刀菌，蓋好蓋玻片輕壓勿留氣泡。然后用無菌滴管向圓濾紙片上滴加滅菌的20% 甘油，至濾紙*濕潤為止；
（4）培養(yǎng)：26℃~28℃培養(yǎng)3 天后開始觀察。
4．人正常組織來源細(xì)胞形態(tài)觀察
   制備查氏培養(yǎng)基平板，在平板中央分別接種青霉、曲霉及鐮刀菌，26℃~28℃下恒溫培養(yǎng)5 天后，觀察并比較菌落形態(tài)。
 0.2ml    anti-CCR5/RANTES      CC趨化因子受體5/依賴激活T細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)蛋白    
 0.2ml    Anti-CCR-3      CC趨化因子受體3抗體    
 0.2ml    Anti-CCR-4      CC趨化因子受體4抗體    
 0.2ml    anti-CD166/ALCAM      活化白細(xì)胞粘附分子抗體    
 0.2ml    Anti-CD18/LFA-1      白細(xì)胞粘附蛋白抗體    
 0.2ml    Anti-CD19       CD19抗體    
 0.2ml    Anti-CD4      鼠抗人CD4單克隆抗體    
 0.2ml    Anti-ICAM-2/CD102      細(xì)胞間粘附分子-2抗體  
人正常組織來源細(xì)胞