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當(dāng)前位置:上海仁捷生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>豬輪狀病毒抗體(RV Ab)試劑盒(ELISA)定性檢測(cè)
l 本試劑盒用于體外定性檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中豬輪狀病毒抗體(RV Ab)。
l 有效期:6個(gè)月
l 保存條件:2-8℃
實(shí)驗(yàn)原理
試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。由于抗體產(chǎn)生量一般比較大,為避免HOOK效應(yīng),試劑盒采用兩步法。往預(yù)先包被豬輪狀病毒抗體(RV Ab)捕獲抗原的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、陰性和陽(yáng)性對(duì)照,經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌,再加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬輪狀病毒抗體(RV Ab)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),判定陰陽(yáng)性。
樣本處理及要求
1. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請(qǐng)1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
需要而未提供的試劑和器材
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標(biāo)板 | 96孔 | 48孔 | 無(wú) |
陰性對(duì)照 | 0.3mL | 0.3mL | 無(wú) |
陽(yáng)性對(duì)照 | 0.3mL | 0.3mL | 無(wú) |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
檢測(cè)抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
底物B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無(wú) |
說(shuō)明書 | 1份 | 1份 | 無(wú) |
自封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無(wú) |
注意事項(xiàng)
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
1. 陰性對(duì)照OD值:小于0.2。
2. 陽(yáng)性對(duì)照OD值:大于0.8。
3、陽(yáng)性判斷(Cut-Off值):陰性對(duì)照OD值+0.25,樣本OD值大于閾值,判定為陽(yáng)性,反之,為陰性。
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