圖 1 論文《GC-IMS技術(shù)助力在模擬血培養(yǎng)中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的鑒定》

胡龍華教授團(tuán)隊(duì)基于KP的4種標(biāo)準(zhǔn)菌株和69株臨床分離株展開研究，使用相同的血培養(yǎng)條件，所有菌株產(chǎn)生的VOCs分別在氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀（FlavourSpec^®）上檢測(cè)，為了觀察亞胺培南（IPM，一種碳青霉烯類抗生素，具有超廣譜、高效能的抗菌活性，對(duì)多種病原體所導(dǎo)致的中重度混合感染有明顯的抗菌作用）對(duì)CSKP和CRKP的作用，標(biāo)準(zhǔn)菌株在血培養(yǎng)3h后分別加入終濃度為0.25mg/mL的IPM，并設(shè)置4個(gè)連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)菌液進(jìn)行VOCs的檢測(cè)。同時(shí)為了探索鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶（CBPM）的KP，對(duì)CRKP各亞型加入CBPM抑制劑進(jìn)行研究。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)流程圖詳見圖 2：

圖 2 實(shí)驗(yàn)研究流程圖

經(jīng)過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)和檢測(cè)，總共檢測(cè)出54種VOCs（其中6種VOCs同時(shí)檢測(cè)到單體和二聚體），包括4種有機(jī)酸、3種醇、3種酯、4種酮、2種吡嗪、2種苯衍生物和30種未定性VOCs。可定性VOCs詳見表 1，同時(shí)發(fā)現(xiàn)KP在培養(yǎng)5h后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的終點(diǎn)，后續(xù)時(shí)間點(diǎn)其VOCs的變化不明顯，因此相應(yīng)的研究實(shí)驗(yàn)均在5h（T2）時(shí)間點(diǎn)開展。

表 1 KP血培養(yǎng)種檢測(cè)到的可定性VOCs

在CRKP和CSKP的鑒定中，在不添加IPM的條件下，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的VOCs，發(fā)現(xiàn)5種VOCs在兩個(gè)組別種存在顯著性差異，相對(duì)于CSKP，CRKP的未定性物質(zhì)3#、21#、28#和正丁醇含量增加，而未定性物質(zhì)30#含量減少（圖 3）。之后主成分分析顯示上述5種VOCs可有效地區(qū)分CSKP和CRKP（圖 4），但這一差異會(huì)隨著時(shí)間推移而消失。

圖 3 檢測(cè)到的5種VOCs在CSKP和CRKP組間的含量差異

（ATCC BAA-1706為CSKP標(biāo)準(zhǔn)菌株，ATCC BAA-1705/2146/2524為CRKP標(biāo)準(zhǔn)菌株）

為了進(jìn)一步探究IPM對(duì)KP的生長(zhǎng)代謝以及釋放的VOCs的影響，在標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)3h（T0時(shí)間點(diǎn)）后，加入終濃度0.25mg/mL的IPM，并在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的VOCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRKP組的VOCs和未加入IPM前保持了相同的變化趨勢(shì)，而CSKP組的VOCs變化較為明顯，相對(duì)于CSKP組，CRKP組的3-甲基丁酸（單體、二聚體）、2-甲基丙烯酸（單體、二聚體）、乙酸、丁二酮和3-羥基-2-丁酮的含量顯著升高，而苯甲醛二聚體和丁酮的含量顯著降低。同時(shí)在未定性的物質(zhì)中，11種VOCs存在上升的趨勢(shì)，而2種VOCs存在下降的趨勢(shì)（圖 5）。

在CRKP中，最為常見的是產(chǎn)CBPM的KP，為研究VOCs的檢測(cè)是否有助于鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP，在標(biāo)準(zhǔn)菌株中加入IPM的同時(shí)，分別設(shè)置加入/不加入CBPM抑制劑進(jìn)行對(duì)照研究，并在后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)觀察VOCs的變化情況。以產(chǎn)A類碳青霉烯酶KP為例，結(jié)果表明，ATCC BAA-1705菌株在加入CBPM抑制劑后，和未加入CBPM抑制劑相比，出現(xiàn)了5種VOCs（苯甲醛二聚體、2,5-二甲基吡嗪二聚體、2-甲基吡嗪二聚體、丁酮和未定性VOCs15#）含量的上升以及13種VOCs（2-甲基丙烯酸單體和二聚體、丙酸單體和二聚體、乙酸、3-羥基-2-丁酮和7種未定性物質(zhì)）含量的下降（圖 6）。通過(guò)PCA分析顯示CBPM抑制劑的加入可鑒定ATCC BAA-1705為A類產(chǎn)CBPM的CRKP（圖 7）。與之相似的是，加入CBMP抑制劑后，產(chǎn)B類碳青霉烯酶KP（ATCC BAA-2146）的VOCs發(fā)生了特異性改變。

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針對(duì)臨床分離的菌株，也先后通過(guò)加入IPM進(jìn)行了CRKP的研究，以及加入CBPM抑制劑進(jìn)行對(duì)產(chǎn)CBPM的CRKP的鑒定探索。本次研究涉及69例臨床分離株，其中25例CSKP和44例CRKP，在44例CRKP中，包含20例KPC陽(yáng)性株、15例NDM陽(yáng)性株、4例IPM陽(yáng)性株和5例CBPM陰性株。

加入IPM后，相對(duì)于CSKP，各亞型的CRKP均出現(xiàn)了部分VOCs的顯著性變化（表 2，圖 8）。結(jié)果表明IPM的加入可有效地鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP，包括KPC陽(yáng)性菌株、NDM陽(yáng)性菌株和IPM陽(yáng)性菌株。

表 2 CRKP臨床分離株加入IPM后相對(duì)于CSKP的VOCs變化

圖 8 加入IPM后各亞型CRKP產(chǎn)生的VOCs的變化（相對(duì)于CSKP）

針對(duì)臨床分離株，通過(guò)VOCs的檢測(cè)鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP，同標(biāo)準(zhǔn)菌株同樣的實(shí)驗(yàn)操作方法，以加入B類酶抑制劑（DPA）為例，在T2時(shí)間點(diǎn)對(duì)VOCs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入DPA后，部分VOCs出現(xiàn)了顯著的變化，包括KPC陽(yáng)性株出現(xiàn)了4種VOC的升高和8種VOCs的降低；NDM陽(yáng)性株出現(xiàn)了8種VOCs的升高和11種VOCs的降低；相比于NDM陽(yáng)性株，IPM陽(yáng)性株出現(xiàn)了1,2-乙二醇的升高和3-羥基-2-丁酮以及4種未定性VOCs的降低（圖 9）。

圖 9 臨床分離株加入IPM和CBPM抑制劑后的VOCs的變化情況

綜上所述，本研究得到以下的結(jié)果：①通過(guò)血培養(yǎng)瓶中VOCs的相對(duì)組分檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)KP的鑒定。②在加入IPM后，CSKP和CRKP釋放的VOCs的差異得到了進(jìn)一步證實(shí)，從而發(fā)現(xiàn)了識(shí)別和鑒定CRKP的潛在VOCs指標(biāo)。③CBPM抑制劑的加入使相應(yīng)菌株中特異性VOCs的組成發(fā)生了明顯的變化，從而為CBPM表型的檢測(cè)提供了一種新的方法，為臨床引起B(yǎng)SI常見的KP的鑒定和耐藥性評(píng)估開辟一種快速的新方法。針對(duì)上述的研究結(jié)果，后續(xù)有待于進(jìn)一步深化研究，開展更大規(guī)模的臨床多中心驗(yàn)證以及前瞻性研究。

氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（GC-IMS）技術(shù)是將氣相色譜的高效分離與離子遷移譜的痕量快速分析優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，經(jīng)過(guò)二次分離后得到保留時(shí)間、漂移時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度的三維譜圖，實(shí)現(xiàn)對(duì)各類樣品中VOCs的痕量檢測(cè)，目前廣泛應(yīng)用于風(fēng)味、泛環(huán)境和醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的研究。設(shè)備具有高靈敏度、適應(yīng)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速分析的特點(diǎn)，相關(guān)的檢測(cè)流程示意圖詳見圖 10，本研究對(duì)于KP產(chǎn)生的VOCs的檢測(cè)操作均在氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀（FlavourSpec^®）上完成。

圖 10 GC-IMS檢測(cè)原理流程示意圖