單克隆抗體(MAb)是針專- -的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體，單克隆技術又名雜交瘤技術起源于1975年，由G. KOhler和Milstein創(chuàng)立。主要原理是利用產(chǎn)生抗體的B細胞與腫瘤細胞雜交融合成雜交瘤細胞，生產(chǎn)抗體。

雜交瘤技術制備單克隆抗 是針對體的主要步驟包括:

(1 )抗原制備，

(2)免疫動物,

(3)免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備,

(4)細胞融合;

(5)雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)，

(6)雜交瘤細胞的篩選;

(7)雜交瘤細胞的克隆化;

(8)單克隆抗體的檢定;

(9)分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立:

(10)單克隆抗體的大量制備。

單克隆抗體的制備過程:

1、免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6- 8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。

2、細胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合, 并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。

3、選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。 在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。

經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子后，及時進行凍存。

5、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生法和體

外培養(yǎng)法。

(1)體內(nèi)誘生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0. 5ml液體石臘或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

(2)體外培養(yǎng)法將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來,各種新型培養(yǎng)技術和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。雜交瘤細胞融合后，要進行篩選后才能使用。雜交瘤細胞分為兩次:一、篩選出雜交瘤細胞;二、 在初選的雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞，這兩次篩選的方法和原理各不相同。

實驗室代做實驗項目