端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)

端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA組分(hTR)于1995年被克隆，其中含有端粒重復(fù)序列的模板(5'-CUAACCCUAAC-3');蛋白質(zhì)組分具有RNA依賴的DNA多聚酶活性，結(jié)構(gòu)尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板區(qū)為模板復(fù)制合成端粒序列。在胚性細(xì)胞等增殖活躍的細(xì)胞中具有端粒酶活性,而在正常成熟體細(xì)胞中端粒酶失活，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都呈端粒酶陽性，而在癌旁組織和正常組織陽性率很低，推測端粒酶可能是一個(gè)廣 泛的腫瘤標(biāo)志物。因此近幾年端粒酶在各種腫瘤中的研究日益深入，同時(shí)促進(jìn)了檢測方法的改進(jìn)與完善。本文對其檢測方法綜述如下。

1基本原理

  端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個(gè)堿基的重復(fù)序列，用聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳可顯示6個(gè)堿基差異的梯帶。1994年Kim建立 了基于PCR基礎(chǔ)上的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)。TRAP反應(yīng)原理見下圖。

首先合成一個(gè)18nt的TS做 上游引物，端粒酶結(jié)合TS末端的GTT并合成ggtag，然后每經(jīng)過一-次轉(zhuǎn)位合成一個(gè)gttag的6堿基重復(fù)序列，端粒酶滅活后，加入-個(gè)24nt的CX做下游引物，經(jīng)過多次變性退火延伸，擴(kuò)增端粒酶延伸產(chǎn)物。

2基本技術(shù)方法

2.1標(biāo)本來源術(shù)摘除組織，針吸活檢組織，胸水，腹水，膀胱或胰管沖洗液，棉拭子所取分泌物和尿液(尚有爭議)等。

2.2端粒酶的提取方法早期采用超聲等物理破碎的方法在不同細(xì)胞中的提取效率差異較大，此后采用去污劑(如CHAPS)裂解的方法在少量細(xì)胞獲取了較穩(wěn)定的端粒酶提取液?，F(xiàn)詳述如下: 40 ~ 100mg冷凍(-70%°C)組織或104 ~ 106沉淀細(xì)胞用冰預(yù)冷的洗液[10mM hepes-KOH(pH7 .5), 1.5mM MgCI2, 10mM KCI,1Mm DTT]洗1次，10000g4°C離心1min， 沉淀加200μ冷裂解液[10mM tris-HCl(Ph7 .5), 1mMMgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-巰基乙醇，0.5%CHAPS, 10%甘油，自動(dòng)勻漿器冰浴中勻漿，450rpm,25min, 16000g49C離心20min,移取上清160μI,部分樣品用于蛋白定量，其余迅速冷凍，-70°C保存。端粒酶經(jīng)小于10次凍融可保持活性穩(wěn)定。部分學(xué)者對某些標(biāo)本用05%Tween-20代替0.5%CHAPS獲得更好的效果。

2.3 TRAP擴(kuò)增50μITRAP體系包含20mM tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgCI, 63mM, KCI, 0.005%Tween-20，1mM EGTA, 50μMdNTP, 0.1ug tS, 1μg T4基因32蛋白，0. 1mg/ml牛血清白蛋白，1 ~ 2μICHAPS細(xì)胞提取液(含6μg)蛋白，0.2 ~ 0.4u[a-32P]dGIP或[a-32P]dGIP(10μCiμl, 3000Ci/mmol),這一-反應(yīng)體系可同時(shí)滿足端粒酶Tap聚合酶的活性需要，239C10min合成端粒酶延伸產(chǎn)物后，949C3s滅活端粒酶，加入0.1μg cX和2U Taq酶，94°C30s, 50°C30s， 72°C1 .5min擴(kuò)增27個(gè)循環(huán)，25μ爐 物進(jìn)行15%PAGE凝膠電泳。

2.4引物設(shè)計(jì)為了防止上、下游引物之間的結(jié)合，在CX引物上設(shè)計(jì)了3個(gè)不匹配堿基(見圖1處),單鏈結(jié)合蛋白T4基因32蛋白可進(jìn)一步避免引物之 間的結(jié)合，TS和CX引物被廣為采用，在上述條件下，只有延伸了三至更多的GGTTAG片斷才有特異擴(kuò)增，即得到從40bp開始的6bp差異的梯帶。Broccol等以5'-GGCGCG(ACCCTA)3-3'代替CX引物，由于增加了G-C含量，可提高退火溫度，進(jìn)一步避免引物間的結(jié)臺，增加特異性。Oncor公司設(shè)計(jì)RP引物代替CX引物，得到從50bp開始的6bp差 異的梯帶。

3擴(kuò)增片斷的檢測

3.1同位素法Kim建立的方法即為同位素法，其應(yīng)用多。采用[a-32P]dGTP或dCTP摻入的報(bào)道很多，但部分學(xué)者用[y-32P]dATP和T 4激酶標(biāo)記TS引物的5端，發(fā)現(xiàn)更易于檢出低水平的端粒酶，同時(shí)更易定量。PAGE凝膠電泳后在X-光片上放射自顯影或用Phosphoimager儀掃描測定3h。同位素法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，100個(gè)永生化細(xì)胞27個(gè)循環(huán)即可檢出，缺點(diǎn)是存在放射性污染，且放射自顯影需8h至兩天以上時(shí)間，時(shí)間較長。

3.2染色法電泳后用SYBR green或EB染色，然后紫外燈下觀察或用CCD圖像系統(tǒng)測定。EB在302nm紫外透射儀和桔紅色紫外濾光片下效果hao，可得與SYBR green相近的敏感性。染色法簡便，快速，靈敏度為100個(gè)永生化細(xì)胞30個(gè)循環(huán)，由于染色帶的信號強(qiáng)度不能精*&確反映其分子數(shù)(大片斷染色更強(qiáng))，因此染色法只能判定相對端粒酶活性，而不能測定端粒酶延伸產(chǎn)物的確切數(shù)量。

3.3熒光法加入10pmo熒光素標(biāo)記(如FAM，F(xiàn)ITC)的TS和/或CX引物擴(kuò) 增，經(jīng)8%的變性PAGE凝膠電泳，DNA測序儀自動(dòng)讀取數(shù)值，片斷管理系統(tǒng)軟件自動(dòng)計(jì)算掃描曲線的峰高和峰面積，從上樣到出結(jié)果僅需90min。熒光系統(tǒng)極敏感，為避免過量擴(kuò)增產(chǎn)物可能給出不可靠結(jié)果，要使用0.5~ 1.0μg的低蛋白量,擴(kuò)增27個(gè)循環(huán)，由于片斷管理系統(tǒng)能自動(dòng)檢出很微弱的熒光，因此不能精*&確測定低水平端粒酶活性[8 ~11]。熒光法的另一-應(yīng)用是于原位一-TRAP分析， 可以在細(xì)胞水平.上檢出端粒酶活性，因此可以判定是哪些細(xì)胞、多少細(xì)胞具有端粒酶活性，而裂解提取法不能知其活性的細(xì)胞來源。原位分析在硅化玻片上進(jìn)行，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。目前只用于新鮮標(biāo)本，用凍存病理標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)尚不成功，需改進(jìn)方法防止凍融中

胞內(nèi)端粒酶的分散及增加標(biāo)本的滲透性等。

3.4 ELISA法TS弓|物5'端標(biāo)以生物素，PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物變性，加入異羥基洋地黃毒苷標(biāo)記的可與擴(kuò)增產(chǎn)物的重復(fù)片斷特異結(jié)合的探針，雜交產(chǎn)物上的生物素與固定在微孔板上的卵白素相結(jié)合，而探針上的異羥基洋地黃毒苷與過氧化物酶標(biāo)記的抗異羥基洋地黃毒苷抗體結(jié)合，然后加入底物，顯色后用酶標(biāo)儀測定。

ELISA法是寶靈曼試劑盒使用的方法，由于沒有電泳，因此觀察不到6bp差異的梯帶。

4質(zhì)量控制

4.1排除假陽性設(shè)置以下四種對照(1)85°C10min滅活端粒酶; (2)端粒酶對RN ase敏感，0. 5μg/10μ提取液+1ugRNase, 37°C, 20min; (3)不加提取液; (4)不加CX或TS引物。以上實(shí)驗(yàn)可排除引物二聚體或PCR污染。

4.2排除假陰性

(1)以陽性細(xì)胞沉淀(106細(xì)胞)的裂解提取液為陽性對照進(jìn)行TRAP分析可以排除由于試劑質(zhì)量不好造成的假陰性。

(2)組織提取液中Taq酶抑制物的存在會造成假陰性，為此Wright等加入一個(gè)150bp的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的獲得方法如下:設(shè)計(jì)TS加長引物: 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC-3和CX加長引物: 5'-(CCCTTA)3CCCTAATAGGCGCTCAATGTA-3',分別在TS和CX引物的3端增加15個(gè)堿基，可與編碼鼠肌蛋白的97 ~ 132位氨基酸的堿基匹配，擴(kuò)增后得到150bp產(chǎn)物，柱純化后備用。每個(gè)TRAP反 應(yīng)加入15ag內(nèi)標(biāo)為模板，TS和CX引|物既可擴(kuò)增端粒酶延伸產(chǎn)物，又可擴(kuò)增150bp的內(nèi)標(biāo)，當(dāng)無150bp擴(kuò)增帶出現(xiàn)時(shí)說明存在Taq酶抑制劑，這對內(nèi)標(biāo)為眾多學(xué)者所采用。也有其它學(xué)者采用200bp或36bp的內(nèi)標(biāo)[4.8,14]。

(3)稀釋提取液可降低酶抑制物濃度，擴(kuò)增帶從無到有說明含酶抑制物。為了減少甚至排除某些標(biāo)本中存在的抑制物的影響，許多學(xué)者在得到端粒酶延伸產(chǎn)物后進(jìn)行酚一氯訪異戊醇(25.24:1)抽提,酒精沉淀純化。

5端粒酶活性的半定量檢測

由于端粒酶活性在少數(shù)正常組織細(xì)胞中有微弱的表達(dá)，而且與細(xì)胞的增殖活躍程度、腫瘤的惡變程度及預(yù)后等有關(guān)，因此半定量測定端粒酶活性在臨床應(yīng)用上意義重大。簡便的方法是通過10倍稀釋提取液以有無6bp差異的梯帶產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)。在任何稀釋度下無產(chǎn)物為(-);不稀釋下有產(chǎn)物為(+); 10倍稀釋下有產(chǎn)物為(++); 100倍稀釋 下有產(chǎn)物為(+++),還可再進(jìn)行1000倍稀釋。 Wright等將內(nèi)標(biāo)引入后使端粒酶活性的半定量檢測成為可能，將6bp差異的梯帶強(qiáng)度總和和除以內(nèi)標(biāo)的強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，在10 ~ 11000個(gè)細(xì)胞間具有很好的線性關(guān)系，而無內(nèi)標(biāo)時(shí)在大于300個(gè)細(xì)胞即進(jìn))平臺。許多學(xué)者采用這種方法描述相對端粒酶活性。Oncor試劑盒(1996年第 2版)提供了更為準(zhǔn)確的方法，用Phosphoimager儀掃描測定凝膠信號，

TPG(Total product Generated,總生成產(chǎn)物)單位((x-0)/)((-0)/C)x100(TSR8為0.1amol), 其中x代表無熱滅活處理標(biāo)本管中梯帶信號總和; x0代表熱滅活管信號; r代表T SR8質(zhì)控管梯帶信號總和，TSR8是人工合成的寡核苷酸鏈，由于TS連接AG(GGTTAG)7構(gòu)成; r0代表無標(biāo)本的裂解液對照管信號; c和cR分別代表無熱滅活處理標(biāo)本管和TSR8質(zhì)控管中內(nèi)對照的信號，每個(gè)TPG單位相當(dāng)于1x10- 3amol或600個(gè)TS引物分子30°C，10min延伸至少4個(gè)端粒重復(fù)序列的數(shù)量，在1 ~ 300TPG(相當(dāng)于約30 ~ 10000個(gè)陽性對照細(xì)胞中所含端粒酶活性)范圍內(nèi)成線性。

6總結(jié)

綜上所述，Kim建立的同位素法靈敏度高應(yīng)用多，但是存在放射性污染且時(shí)間較長，染色法操作簡便時(shí)間短，不過只能檢測相對端粒酶活性，熒光法只用于新鮮樣本，在日常的應(yīng)用中大家可根據(jù)具體情況選擇不同方法或?qū)ζ溥M(jìn)行簡單的組合操作。

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