神經(jīng)HRP示蹤顯色液(TMB法)說明書

 上個世紀(jì) 70 年代，Kristensopn 和 Olsson 報道了HRP可神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體，經(jīng)組織化學(xué)方法可顯示出神經(jīng)元的輪廓，從而開發(fā)出 HRP  追蹤神經(jīng)元示蹤技術(shù)，即為 HRP 法。3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)是非常優(yōu)越的酶免試驗顯色劑，能溶解于多種有機(jī)溶劑和雙蒸水中，為穩(wěn)定的無色溶液，不適量過氧化脲或雙氧水不緩沖液混   勻后，不過氧化物酶作用產(chǎn)生清晰的藍(lán)色產(chǎn)物，極易觀察，在辣根過氧化物酶的催化下 , TMB 會產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，該沉淀不溶于水和乙醇，顯色后呈藍(lán)色，可在顯微鏡下觀察。

神經(jīng) HRP 示蹤顯色液(TMB 法)是動物經(jīng)麻醉、注入HRP后，游離或絡(luò)合型的 HRP 不氧化劑反應(yīng)生成絡(luò)合物，該絡(luò)合物氧化供氫的 TMB 顯色劑，呈藍(lán)色，在顯微鏡下清晰可見，該檢測法較 DAB  法靈敏。該顯色液僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

(一)、準(zhǔn)備工作

1、動物麻醉：多用(3.5%)戊巴比托妥鈉作為麻醉劑，大鼠的麻醉劑量為 0.25-0.35ml/100g。

2、導(dǎo)入HRP：有壓力注射法、電泳法以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的注射涂抹等法。

3、確定動物存活期。

4、動物灌注：麻醉后，經(jīng)左心室升主動脈插管行心內(nèi)灌注固定。先用生理鹽水或 PBS 快速灌注。隨后用 4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，時間控制在 30-40min。后用 10% 蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)。

5、取材：取組織置于 20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中，切片厚度 40μm，存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。

(二)、顯色反應(yīng)

1、配制 TMB孵育液：取適量的TMB assay buffer 和TMB顯色液，按 TMB assay buffer： TMB顯色液=39:1 的比例混合，即為 TMB孵育液，即配即用，不宜保存。

2、配制TMB顯色工作液：取適量的TMB孵育液和TMB增強(qiáng)劑，按TMB孵育液：TMB 增強(qiáng)劑=2000～8000：1 的比例混合(具體比例應(yīng)根據(jù)具體時間摸索確定)，即為TMB顯色工作液，即配即用，不宜保存。

3、配制 1×TMB Wash buffer：取適量的TMB Wash buffer(20×)，按TMB Wash buffer： 蒸餾水=1:19 的比例混合，即為 1×TMB Wash buffer。室溫保存6個月有效。

4、切片用蒸餾水清洗 3 次，每次 2min。

5、切片入10ml TMB孵育液(提前 20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動。

6、切片入10ml TMB 顯色工作液(提前 20℃溫育)，避光孵育 20min，其間不斷晃動。7、漂洗：取10ml左右的1×TMB Wash buffer 漂洗切片2-3 次，每次 5min。

8、貼片，載玻片用鉻明礬明膠包被，室溫空氣干燥。

9、脫水、透明步驟按如下操作：

 ①蒸餾水 10s

②70%乙醇  10s

③95%乙醇  10s

④100%乙醇 2 次，每次 10s

⑤二甲苯2次，每次 2～5min。

1. 中性樹膠封片，顯微鏡下觀察藍(lán)色反應(yīng)。

注意事項：

1、如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀，表明TMB底物反應(yīng)過于強(qiáng)烈。

2、所用器皿必須潔凈，避免含有氧化劑或還原劑，否則會產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。

3、TMB顯色液避免反復(fù)凍融，以免顯色效率下降。

4、TMB增強(qiáng)劑注意密閉保存，否則顯色效率下降。

有效期： 12 個月內(nèi)有效。