本文利用島津三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-TQ8050NX 結(jié)合AOC-6000頂空進(jìn)樣以及島津揮發(fā)胺專用柱SH-Volatil Amin，建立了動(dòng)物類中藥中三甲胺的含量測定方法。
在0.1~10μg/mL濃度范圍內(nèi)三甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好, 線性相關(guān)系數(shù)0.9999。0.1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積RSD為6.40%。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，加標(biāo)濃度為50和500mg/kg，平均加標(biāo)回收率為98.43%和95.64%，對應(yīng)RSD分別為9.10%和 2.06%。此方法可為動(dòng)物類中藥中三甲胺定量分析提供參考，同時(shí)也為動(dòng)物類中藥中腥臭氣味來源研究提供思路。
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創(chuàng)新性樣品制備方法，有效消除三甲胺易揮發(fā)性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。
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頂空進(jìn)樣結(jié)合GC-MS/MS測定，有效抑制了基質(zhì)化學(xué)干擾，保證結(jié)果可靠性。
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堿改性SH-Volatil Amin有效提升了對三甲胺的惰性，改善峰形及分析穩(wěn)定性。
三甲胺(Trimethylamine, TMA)是一種帶腥臭氣味的揮發(fā)性有機(jī)物，廣泛存在于肉類和海鮮等動(dòng)物源性食品中。其主要來源于動(dòng)物體內(nèi)一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑氧化三甲胺(Trimethyamine Oxide, TMAO)的酶促反應(yīng)，是判斷動(dòng)物源性食物新鮮度的重要指標(biāo)。
動(dòng)物類中藥源自動(dòng)物全體、器官、組織或加工制品, 其主要成分為蛋白、多肽類, 在臨床應(yīng)用中療效確切。但藥物腥臭氣突出, 例如中醫(yī)臨床常用的地龍、水蛭、美洲大鐮、雞內(nèi)金等均有明顯腥臭氣。TMA已被證實(shí)是動(dòng)物類中藥腥臭氣味的相同關(guān)鍵氣味物質(zhì)之一，患者服藥順應(yīng)性對藥物中三甲胺含量提出了要求，因此需要開發(fā)用于動(dòng)物類中藥中三甲胺含量測定的方法。
目前食品中三甲胺含量測定方法較為成熟，并建立了國家標(biāo)準(zhǔn) GB 5009.179-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三甲胺的測定》，但該檢測方法容易受到三甲胺易揮發(fā)性和高吸附性干擾，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
本文利用島津GC-MS/MS 結(jié)合AOC-6000頂空進(jìn)樣以及島津揮發(fā)胺專用柱SH-Volatil Amin，采用獨(dú)特樣品制備方法，建立了動(dòng)物類中藥中三甲胺含量測定方法，并測定了地龍、水蛭和美洲大鐮等實(shí)際樣品中三甲胺含量。該方法靈敏度高，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性良好，可為動(dòng)物類中藥中三甲胺檢測提供參考。
1.1 儀器
GCMS-TQ8050NX三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀
AOC-6000自動(dòng)進(jìn)樣器
1.2 分析條件
頂空參數(shù)：
恒溫爐溫度：80 ℃
頂空針溫度：100 ℃
平衡時(shí)間：30 min
GC-MS/MS參數(shù)：
色譜柱：SH-Volatil Amin, 30 m x 0.32 mm x 5.0 μm, P/N：R227-36326-01
柱溫程序：40 ℃(0.5min)_20 ℃/min_200℃(5 min)
進(jìn)樣量：1 mL
進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣
分流比：10：1
進(jìn)樣口溫度：200 ℃
載氣控制方式：恒流模式
柱流量：2 mL/min
離子化方式：EI
離子源溫度: 200 ℃
色譜質(zhì)譜接口溫度 : 230 ℃
檢測器電壓：調(diào)諧電壓+0.5kV
采集模式：MRM，離子對信息見表1
樣品前處理
3.1 三甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量色譜圖
使用5%三氯乙酸溶液配制三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液系列, 濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/mL(以三甲胺計(jì))，精密量取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL分別置于預(yù)制好的頂空瓶石蠟層上部，壓蓋密封后，進(jìn) GC-MS/MS分析。以三甲胺濃度為橫坐標(biāo)，三甲胺定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示，線性相關(guān)系數(shù)如表2所示，三甲胺質(zhì)量色譜圖見圖3。
3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)及檢出限
取三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(以三甲胺計(jì)，0.1μg/mL) 2mL置于預(yù)制好的頂空瓶石蠟層上部，平行制備樣品6份并連續(xù)進(jìn)樣，用于考察三甲胺峰面積的重復(fù)性，測定結(jié)果見表3。以3倍信噪比(峰至峰)計(jì)算檢出限，三甲胺儀器檢出限見表2。
3.4 加標(biāo)回收率
三甲胺是動(dòng)物類中藥中內(nèi)源性化合物，同時(shí)由于三甲胺的易揮發(fā)性，在本實(shí)驗(yàn)中，選擇三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。美洲大鐮中加標(biāo)濃度分別為50和500mg/kg，按照前ER每個(gè)加標(biāo)濃度平行制備3份加標(biāo)樣品，考察回收率和RSD。50mg/kg加標(biāo)水平下，加標(biāo)回收率分布在88.08%-103.63% 之間，RSD為 9.10%；500 mg/kg加標(biāo)水平下，加標(biāo)回收率分布在93.39%-97.08%之間，RSD為2.06%；詳細(xì)結(jié)果見表4。
3.5 實(shí)際樣品分析結(jié)果
選取產(chǎn)地不同的地龍、美洲大鐮和水蛭為樣品，按前述樣品處理流程進(jìn)行樣品制備，并采用上述儀器條件測定，三甲胺檢測結(jié)果如表5所示。
本方法采用島津GCMS-TQ8050NX結(jié)合AOC-6000 頂空進(jìn)樣以及島津揮發(fā)胺專用柱SH-Volatil Amin，建立了動(dòng)物類中藥中三甲胺含量測定方法，并測定3種動(dòng)物類中藥樣品中三甲胺含量。在0.1~10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，三甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)0.9999；根據(jù)0.1μg/mL三甲胺標(biāo)樣數(shù)據(jù)，以3倍信噪比(峰至峰)計(jì)算儀器檢出限為0.63 μg/L；在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，濃度為0.1 μg/mL三甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積RSD為6.40%；在50mg/kg和500 mg/kg加標(biāo)水平下，平均加標(biāo)回收率為98.43%和95.64%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法采用GC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式結(jié)合獨(dú)特樣品前處理方式，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，能夠有效監(jiān)測動(dòng)物類中藥中三甲胺含量。
小貼士
含-NH-的化合物容易和色譜柱熔融石英表面-Si-OH形成分子間氫鍵，容易導(dǎo)致色譜峰拖尾和柱上吸附，影響胺類分析結(jié)果準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
方法選擇：對于甲胺、二甲胺、三甲胺檢測一方面可以考慮離子色譜，另一方面可以考慮氣相色譜，分析揮發(fā)胺相對更簡單快速。
GC柱選擇：如使用常規(guī)色譜柱，建議增大膜厚以改善對胺類惰性，但吸附問題無法徹底消除，因此更建議堿改性揮發(fā)胺專用柱，一方面通過堿改性真實(shí)提升對胺類惰性，另一方面高膜厚增加了對揮發(fā)胺保留，從而有效分離揮發(fā)胺。
產(chǎn)品詢價(jià)
胺類專用柱
SH-Volatil Amin
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