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為向玻璃管中填入固定相，以流動相溶劑浸潤后在上方倒入待分離的溶液，再滴加流動相，因為待分離物質(zhì)對固定相的吸附力不同，吸附力大的固著不動或移動緩慢，吸附力小的被流動相溶劑洗下來隨流動相向下流動，從而實現(xiàn)分離。

 

紙色譜

 

以濾紙條為固定相，在紙條上點上待分離的混合溶液的樣點，將紙條下端浸入流動相溶劑中懸掛，溶劑因為毛細作用沿濾紙條上升，樣點中的溶質(zhì)從而被分離。

 

薄層色譜

 

是在玻璃板上涂以固定相涂層，然后點樣，下端浸入溶劑，同樣自下而上分離。常用于探索柱色譜實驗條件，溶劑和固定相的選擇等。

 

常用固定相有石膏、氧化鋁、蔗糖、淀粉等，常用流動相為水、苯等各種有機溶劑。

 

流動相因素

 

1.流動相pH

 

不同基質(zhì)的填料具有不同的pH適用范圍。常溫下無定形硅膠在純水中的溶解度約為100mg·L-1，且在pH1～9的范圍內(nèi)溶解的硅膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對于硅膠基質(zhì)的填料,其所能承受的流動相pH范圍約為1～8。鍵合相硅膠填料則由于鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應(yīng)范圍大大增加，如現(xiàn)在廣泛使用的反相色譜填料C18(十八烷基硅烷鍵合硅膠)，其pH適用范圍可達2～10。當流動相pH值超出酸性范圍時，鍵合相易發(fā)生水解而流失；當流動相pH超出堿性范圍時，會加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，這兩種反應(yīng)均是不可逆反應(yīng)，特別是在溫度較高（>40℃）的環(huán)境下，會使柱效迅速降低而報廢。

 

2.流動相變質(zhì)

 

當前使用最為廣泛的是硅基鍵合相填料，當以水溶液作為流動相或流動相中含有一定濃度的磷酸鹽緩沖液時，水溶液中或緩沖鹽溶液中會滋生出一些細菌或霉菌，從而堵塞固定相顆粒間的空隙。特別是對于多元自動比例混合的高效液相色譜儀來說,水相或緩沖鹽相獨立存貯，因存放時間較長而容易發(fā)生此類問題。

 

3.流動相純度

 

目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑范圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會有大量的流動相通過,如流動相含有微量不溶性雜質(zhì)顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機械性堵塞,引起柱壓升高而無法正常使用。

 

4.其它因素

 

如，流動相的極性對柱子也有一定影響，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質(zhì)會破壞硅膠填料柱，正丁醇、二氯甲烷等極性小的物質(zhì)會破壞化學(xué)鍵合硅膠柱，堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。