鏈霉素快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物鏈霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗鏈霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物鏈霉素的含量。

二、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
2. 孵育溫度：       37℃
3. 孵育時間：       30min～30min～15min
4. 樣本檢測下限

雞 肉 ··············································  1 ppb

雞肝、牛奶 ······································  4 ppb

蜂 蜜/蜂王漿 ···································  2 ppb

1. 交叉反應(yīng)率

鏈霉素  ··········································   100%

慶大霉素  ······································· ﹤0.1%

雙氫鏈霉素  ····································  108%

卡那霉素  ······································· ﹤0.1%

1. 樣本回收率

牛    奶  ····································  85±22%

雞肉組織  ····································  80±22%

蜂蜜/蜂王漿   ······························  75±22%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱、恒溫水浴鍋

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：氫氧化鈉、乙腈、正己烷、三氯yi酸

五、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

1. 樣本前處理需配制：

配液1  0.5%三氯yi酸溶液

取0.5g三氯乙suan加去離子水定容100ml。

配液2  3%三氯乙suan溶液

取3g三氯乙suan加去離子水定容100ml。

配液3  1M NaOH溶液：

稱4g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液4  0.1M NaOH溶液：

稱0.4g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液5  樣本復(fù)溶液：

將10X濃縮復(fù)溶液用去離子水1：9稀釋。

1. 樣本處理：

（a）牛奶處理方法

1. 取牛奶1ml，按1:39稀釋，混合30s。（50µl牛奶+1950µl樣本復(fù)溶液）
2. 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  40倍 

（b）雞肉處理方法

1. 取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本,加4ml 3%三氯yi酸，充分混勻2min； 室溫4000r/min以上，離心10min；
2. 取上清液100µl，加入100µl0.1M NaOH，再加入300 µl樣本復(fù)溶液，充分混勻；
3. 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  10倍 

（c）雞肝處理方法

1. 取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本,加6ml 0.5%三氯yi酸和2ml乙腈，充分混勻5min；
2. 室溫4000r/min以上，離心10min；
3. 取2ml上清液加入2ml正己烷，充分混勻靜置3min，取0.5ml下層清亮液體，室溫4000r/min以上，離心5min；
4. 取50µl下層清亮液（若有分層，須去除掉上層液體取下層清亮液體），加入450µl樣本復(fù)溶液混勻，混合30s；
5. 取50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù):  40倍

（d）蜂蜜、蜂王漿處理方法

1. 稱量1±0.05g 樣本加入2ml 去離子水，振蕩至*溶解；
2. 室溫4000r/min以上離心10 min。
3. 取100µl上清液，加入400µl樣本復(fù)溶液混勻，混合30s；
4. 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 10倍 

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

1. 測定前應(yīng)須知：

1. 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3. 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4. 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1. 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3. 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4. 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6. 倒出孔中液體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加入250µl/孔洗滌液，15-30s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。
7. 酶標(biāo)記物：加入酶標(biāo)記物100µl/孔，用蓋板膜封板，37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。
8. 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。
9. 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含鏈霉素量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.4ppb為1.415；1.6ppb為0.74；6.4ppb為0.313；25.6ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是6.4ppb～25.6ppb；樣本2的濃度范圍是0.4ppb～1.6ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中鏈霉素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中鏈霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項

1. 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4. 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6. 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7. 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 該試劑盒jia反應(yīng)溫度為37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1. 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
2. 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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