您好, 歡迎來(lái)到化工儀器網(wǎng)! 登錄| 免費(fèi)注冊(cè)| 產(chǎn)品展廳| 收藏商鋪|
提供商
上海研謹(jǐn)生物科技有限公司資料大小
113.7KB資料圖片
下載次數(shù)
220次資料類型
PDF 文件瀏覽次數(shù)
1182次琥珀酸脫氫酶(Succinate Dehydrogenase,SDH)試劑盒說(shuō)明書
微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
SDH(EC 1.3.5.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶,位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶,是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。
此外,為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。
測(cè)定原理
SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸(PMS)傳遞還原2,6-
二氯酚靛酚(DCPIP),并且在600nm 處具有特征吸收峰,通過(guò)600nm吸光度的變化,測(cè)定2.6-DPIP 的還原速度,代表SDH 酶活性。
需自備的儀器和用品
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:20mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑三:1.5mL×1 支,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;
樣本的前處理
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、稱取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g,4℃離心5min。
3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
4、上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的SDH(此步可選做)。
5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎, 冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體SDH活性測(cè)定。
測(cè)定步驟和加樣表
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
(1)在試劑四中加入18mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑4℃保存一周;
(2)在試劑五中加入1mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存一周;
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL試劑四,混勻,立即記錄600nm處20s時(shí)的吸光值 A1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
SDH 活性的計(jì)算
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
SDH 活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T
=952×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
SDH 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
SDH 活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×10 4 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
SDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=1904×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
SDH 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
SDH 活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
| |||
| |||
| |||
| |||
請(qǐng)輸入賬號(hào)
請(qǐng)輸入密碼
請(qǐng)輸驗(yàn)證碼
以上信息由企業(yè)自行提供,信息內(nèi)容的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和合法性由相關(guān)企業(yè)負(fù)責(zé),化工儀器網(wǎng)對(duì)此不承擔(dān)任何保證責(zé)任。
溫馨提示:為規(guī)避購(gòu)買風(fēng)險(xiǎn),建議您在購(gòu)買產(chǎn)品前務(wù)必確認(rèn)供應(yīng)商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量。