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目的

本應(yīng)用表明Sievers*Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀（BET，Bacterial Endotoxins Testing）所使用的起效光密度（OD，Optical Density）值與96孔微孔板測試所使用的起效光密度值是等效的。Sievers Eclipse微孔板的孔的形狀和光路徑長度不同于96孔板的孔的形狀和光路徑長度，因此需要用比爾定律（Beer’s Law）和吸光度方程來重新計(jì)算Sievers Eclipse微孔板的光密度值。證明上述兩種平臺的光密度值的等效性非常重要，這是因?yàn)樵趧討B(tài)顯色分析中，起效光密度值用于確定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的起效反應(yīng)時(shí)間。

概述

動態(tài)內(nèi)毒素測試依賴于光密度值和內(nèi)毒素濃度變化之間的反比關(guān)系。光密度是“用分光光度計(jì)測量的特定波長的有機(jī)分子懸浮液或溶液所吸收的光量。”1當(dāng)光通過含有標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）和鱟試劑（LAL，Limulus Amoebocyte Lysate，鱟變形細(xì)胞溶解物）的混合液的光學(xué)孔時(shí)，軟件就會報(bào)告光密度值的變化。對于動態(tài)分析法來說，起效光密度值是用來確定起效反應(yīng)時(shí)間的恒定值。內(nèi)毒素濃度高的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)速度較快，溶液顏色會變黃，使到達(dá)光電二極管的光量較少，因而光密度值較高。起效反應(yīng)時(shí)間（即達(dá)到起效光密度所需的時(shí)間）越短，樣品中的內(nèi)毒素含量就越高。每次測試完畢后，軟件都會生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示起效反應(yīng)時(shí)間（以對數(shù)形式）和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素濃度（以對數(shù)形式）之間的線性關(guān)系。然后將反應(yīng)性樣品和陽性產(chǎn)品對照液（PPC，Positive Product Controls）的起效反應(yīng)時(shí)間同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，得出內(nèi)毒素的量化結(jié)果。測得的起效光密度值經(jīng)過優(yōu)化，都被概括在使用說明（IFU，Instructions For Use）中。起效光密度值可以是一個(gè)定值，也可以是一系列值。起效光密度也被稱為“閾值光密度”或“反應(yīng)光密度”。

Sievers Eclipse的等效光密度

不同的生產(chǎn)商或供應(yīng)商所提供的96孔板的光路徑長度略有不同。平底96孔板的孔通常是截錐形，使微孔板容易從模具上脫模。我們用幾家主要的微孔板生產(chǎn)商、儀器生產(chǎn)商、LAL供應(yīng)商所提供的數(shù)據(jù)，根據(jù)96個(gè)孔中共有200µL溶液來確定光路徑長度，得出的數(shù)值范圍是5.707 mm-6.306 mm。為了將上述范圍縮小到一個(gè)定值，位于美國科羅拉多州博爾德市的Sievers分析儀應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室重新測量了各種96孔板，得出了光路徑長度范圍的中間值。然后將該值代入以下方程式，就可以將96孔板測試中使用的起效光密度值轉(zhuǎn)換為適用于Eclipse平臺的等效起效光密度值。

用上面的計(jì)算公式以及96孔板和Eclipse微孔板的實(shí)測路徑長度，算出表1中的光密度值，用于Eclipse軟件。

我們并排測試了96孔板和Eclipse微孔板的光密度值，確認(rèn)這兩種平臺的所有的內(nèi)毒素、PPC、%CV（變異系數(shù)）值都是等效的。如果鱟試劑生產(chǎn)商提供了光密度值范圍，則重新計(jì)算整個(gè)范圍，然后在Sievers Eclipse平臺上進(jìn)行測試。兩種平臺的所有范圍之間的等效性都得到確認(rèn)，從而證明數(shù)值轉(zhuǎn)換是正確的，生成的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。如果您的實(shí)驗(yàn)室使用各種起效光密度值，建議您進(jìn)行測試，確定哪個(gè)值適用于各個(gè)樣品，因?yàn)楫?dāng)測試完畢后，就無法在Sievers Eclipse軟件中更改起效光密度值。表1可以幫助您確定適用于您的樣品的等效光密度值。

結(jié)論

雖然Eclipse BET平臺和96孔微孔板的起效光密度值不同，但我們可以用現(xiàn)成的物理方程式來精確計(jì)算出它們的等效值，因此用戶可以放心使用Eclipse平臺測量出來的內(nèi)毒素結(jié)果。如需詳細(xì)的指導(dǎo)，請向您所在地的Sievers業(yè)務(wù)代表或應(yīng)用專家查詢。

參考文獻(xiàn)

1.McCullough,Karen Zink.The Bacterial Endotoxins Test:A Practical Approach.DHI Publishing,LLC,2011.

2.Helmenstine,Anne Marie.Beer’s Law Definition and Equation.ThoughtCo,2019.

• SieversEclipse月食細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀

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