多重?zé)晒饷庖呓M化試劑盒-四色-100T主要用于組織的石蠟切片、TMA芯片的熒光法免疫組化染色。

作為Biogradetech-d家代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦Biogradetech熱銷產(chǎn)品多重?zé)晒饷庖呓M化試劑盒-四色-100T。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

多重?zé)晒饷庖呓M化試劑盒-四色-100T檢測(cè)原理：

本試劑盒采用多標(biāo)記免疫熒光染色技術(shù)，將抗原、抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)同酪胺信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合，選用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗抗體，對(duì)試劑盒中的熒光染料進(jìn)行活化，將信號(hào)共價(jià)結(jié)合到抗原上。借助于不同的熒光染料標(biāo)記，通過(guò)多輪染色實(shí)現(xiàn)組織或細(xì)胞單個(gè)樣本的原位多靶點(diǎn)染色。酪酰胺信號(hào)放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過(guò)氧化酶（HRP）對(duì)靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法，類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 ，TSA 技術(shù)同樣采用 HRP 標(biāo)記的二抗，同樣有對(duì)應(yīng)的“顯色”步驟（HRP 催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的l氨酸等殘基共價(jià)結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法或者抗體洗脫液洗去非共價(jià)結(jié)合的一抗-二抗-HRP 復(fù)合物，重復(fù)下一種一抗-hrp 二抗來(lái)第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。

TSA 詳細(xì)原理是利用酪胺 Tyramide 的過(guò)氧化物酶反應(yīng)（酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)），產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基（包括s氨酸、z氨酸和l氨酸殘基）結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到 10-100 倍增強(qiáng)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在 HRP 和過(guò)氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的l氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理，前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測(cè)結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無(wú)需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問(wèn)題，大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說(shuō)，如果用 TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。

染料使用方法：

TSA 熒光染料工作液=Tyramide reagent + Tyramide Amplification Buffer ；

Tyramide reagent：Tyramide Amplification Buffer =1:100 ；

Tyramide reagent與 Tyramide Amplification Buffer 的稀釋比例可以根據(jù)具體情況靈活調(diào)整優(yōu)化，最佳范圍為 1:50-1:200(1:100 大部分情況能得到最佳結(jié)果）；

一般建議若一抗孵育時(shí)間常溫 1h-3h 內(nèi)，建議稀釋比例 1:50-1:200, 若一抗孵育時(shí)間 4 度過(guò)夜（12h 或以上），建議稀釋比例 1:100-1:200 或更高。

存儲(chǔ)條件

1. 試劑盒有效期為12個(gè)月，開(kāi)封后有效期3個(gè)月，請(qǐng)盡快使用。

2. 2~8℃避光保存，使用前室溫溶解并充分混勻。

3. 生產(chǎn)日期和失效日期見(jiàn)包裝標(biāo)簽。

樣本要求

1.福爾馬林固定的組織蠟塊或切片，大塊組織或TMA均可。

2.樣本需緊貼載玻片，無(wú)褶皺、破損、劃傷或污漬。

3.樣本應(yīng)大于1000個(gè)細(xì)胞。

4.蠟塊需包埋實(shí)體瘤組織。壞死瘤組織、細(xì)針穿刺物、細(xì)胞甩片樣本會(huì)影響染色效果。

5.建議使用10%中性福爾馬林固定組織，固定時(shí)間一般為18～24小時(shí)。

6.切片厚度為4um左右，請(qǐng)使用防脫載玻片。建議切片樣本在制備后一周內(nèi)進(jìn)行多標(biāo)記免疫熒光染

色。

7.石蠟切片樣本制備過(guò)程不要添加任何粘合劑。樣本應(yīng)置于載玻片正面、中央位置。

設(shè)備耗材

1. 檢驗(yàn)所需設(shè)備器材：熒光成像設(shè)備、通風(fēng)櫥、微量移液器、恒溫干燥箱、微波爐、計(jì)時(shí)器等。

2. 檢測(cè)所需耗材器皿：免疫組化筆、抗原修復(fù)盒、染色缸、孵育濕盒、蓋玻片、洗瓶、量筒等。

試劑制備

1. 通用試劑：滅菌去離子水、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、抗原修復(fù)液、封閉液、TBST等。

2. 通過(guò)將Tyramide Amplification Bufer Plus PartA和PartB兩個(gè)組分等體積混合來(lái)制備1X的工作濃度緩沖液。為每個(gè)樣品準(zhǔn)備 100ul工作液。

3. 試劑配制：?jiǎn)紊玊SA熒光染料使用信號(hào)放大反應(yīng)液1:100稀釋制備工作液；DAPI使用無(wú)菌水1:100稀釋制備工作液，

現(xiàn)用現(xiàn)配。

4. HRP標(biāo)記二抗為工作液，直接使用，無(wú)需稀釋。請(qǐng)注意試劑盒中二抗反應(yīng)性要求，標(biāo)配為HRP羊抗兔二抗。

技術(shù)要點(diǎn)

1. 與直接使用染料-二抗偶聯(lián)物相比，使用Tyramide Amplification Kits 的免疫熒光成像通常顯示出更高的靈敏度和

更強(qiáng)的信號(hào)。因此，可以使用較低濃度的一抗，以盡量減少來(lái)自非特異性結(jié)合的背景光。我們建議進(jìn)行一抗滴定以找到最佳濃度

2. 如果擔(dān)心背景熒光，我們建議并排運(yùn)行未與一抗孵育的陰性對(duì)照。確保該陰性對(duì)照在孵育和洗滌期間不會(huì)被陽(yáng)性樣品中的試劑交叉污染。對(duì)于組織樣本，我們還建議對(duì)未染色的對(duì)照(未添加抗體或酪胺)進(jìn)行成像，以確定組織自發(fā)熒光對(duì)背景的影響。

3. 我們推薦使用5ug/mL 的 HRP 偶聯(lián)物。 降低濃度可能會(huì)損害信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度。

4. 我們建議Tyramide reagent 按 1:100稀釋。更高的濃度除了可能得到更強(qiáng)的信號(hào)外，還可能導(dǎo)致更高的背景?？梢酝ㄟ^(guò)滴定(從 1:50 到1:500)為您的特定應(yīng)用找到最佳濃度。

5. 通過(guò)在每次酪胺反應(yīng)后進(jìn)行 HRP 淬滅或抗體剝離，可以依次使用多個(gè)Tyramide reagent 標(biāo)記同一樣品上的不同目標(biāo)。共價(jià)連接到樣品上的染料或生物s將保留。

6. 在進(jìn)行鏈霉親和素/生物s檢測(cè)時(shí)，我們建議阻斷樣品中的內(nèi)源性生物s以降低背景。

實(shí)驗(yàn)流程

操作步驟

1)脫蠟水合 

a)新鮮二甲苯浸片5min，重復(fù)3次。

b)梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 5min。

c)滅菌水浸片1min，重復(fù)3次。

d)10%中性福爾馬林浸片10min（防止脫片），滅菌水浸洗切片1min，重復(fù)3次。（可選）

e)1~3% H2O2室溫孵育5~10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。（可選）

f)滅菌水浸洗切片1min，重復(fù)3次。

2) 微波修復(fù)抗原 

a) 將脫蠟水合后的切片置于抗原修復(fù)盒中，加入足夠的1×抗原修復(fù)液。

b) 將抗原修復(fù)盒置于微波爐內(nèi)高火煮沸。

c) 低檔火力維持10~15min（注意補(bǔ)充抗原修復(fù)液，防止蒸發(fā)過(guò)度導(dǎo)致干片）。

d) 取出抗原修復(fù)盒，自然冷卻至室溫。

3) 封閉 

a) 切片用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復(fù)3次。

b) 去除切片上殘存洗液。

c) 用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域。

d) 室溫保濕輕微震蕩10~30min。

4) 一抗孵育 

a) 去除切片上的封閉液。

b) 滴加適量的一抗溶液，浸沒(méi)樣本區(qū)域。

c) 室溫保濕震蕩孵育1h（需針對(duì)不同抗體做優(yōu)化調(diào)整）。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復(fù)3次。

5) 二抗孵育 

a) 去除切片上殘存的洗液。

b) 直接滴加HRP標(biāo)記二抗溶液，浸沒(méi)樣本區(qū)域。

c) 室溫保濕震蕩孵育10~30min。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復(fù)3次。

6) 熒光染色放大信號(hào)

a) 去除切片上殘存的洗液。

b) 滴加適量1×染料工作液（單色TSA熒光染料用信號(hào)放大液1:100稀釋），浸沒(méi)樣本區(qū)域。

c) 室溫保濕震蕩孵育10~15min。

d) 用1×TBST Buffer浸洗切片2min，重復(fù)3次。

7) 微波修復(fù)降噪 

a) 按步驟2微波修復(fù)一次，室溫自然冷卻至室溫。

b) 滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

c) 單染結(jié)束，DAPI染色后封片觀察或從步驟3（封閉）開(kāi)始追加后續(xù)染色。

8) DAPI染色 

a) 去除切片上殘存洗液，滴加DAPI工作液，室溫保濕震蕩孵育10~20min。

b) 1×TBST Buffer 浸洗切片，室溫3min。

c) 滅菌水浸洗切片2min。

9) 封片觀察 

a) 待切片微干，滴加增強(qiáng)型抗淬滅封片劑10~30μL。

b) 加蓋玻片，密封劑（如指甲油）封邊，防止樣本干燥。

c) 閱片，對(duì)染色后的組織切片在熒光成像設(shè)備中采集圖像、觀察并進(jìn)行判讀。

結(jié)果判讀

1. 微波修復(fù)抗原、孵育時(shí)間及溫度的變化均有可能得出錯(cuò)誤結(jié)果。

2. 在每次染色過(guò)程中，必須有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。

3. 若對(duì)照實(shí)驗(yàn)不能顯示正確的染色，則應(yīng)判定該批次樣本的檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

局限說(shuō)明

1. 免疫組化染色過(guò)程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個(gè)步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果。

2. 陽(yáng)性信號(hào)定位不正確即為假陽(yáng)性，包括著色不勻、背景著色、邊緣效應(yīng)，另外組織的某些特定成分也能導(dǎo)致假陽(yáng)性。

3. 抗原修復(fù)方法不當(dāng)或一抗效價(jià)降低、失效，均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

4. 過(guò)度或不足的染色都可能影響結(jié)果的正確解釋。

5. 本試劑盒只在10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片上進(jìn)行了驗(yàn)證。

性能指標(biāo)

1. 符合性：取符合性組織切片，經(jīng)相應(yīng)的免疫組化實(shí)驗(yàn)后，陽(yáng)性對(duì)照染色結(jié)果為陽(yáng)性，陰性對(duì)照染色結(jié)果為陰性。

2. 批內(nèi)重復(fù)性：取同一批次的試劑盒，檢測(cè)同一組織樣本切片3片，染色結(jié)果一致。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒只用于免疫組化，不做其它用途。

2. 本試劑盒僅限于專業(yè)人員使用。

3. 應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

4. 超過(guò)有效期的試劑活性可能降低，導(dǎo)致假陰性結(jié)果，因此不得使用超過(guò)有效期的試劑。

5. 若將本試劑盒的染色組分與其它公司的產(chǎn)品混合使用，在染色過(guò)程中可能出現(xiàn)異常情況。

6. 脫蠟不c底，嚴(yán)重影響染色效果

7. 為了防止可能出現(xiàn)的假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需有陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行。

8. 使用本試劑盒染色中所產(chǎn)生的各種廢棄物都應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》進(jìn)行處理。

Biogradetech成立于2015年，總部位于美國(guó)加利福尼亞州，早期以產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)服務(wù)起家，逐步發(fā)展了廣泛的產(chǎn)品線，并將其商業(yè)化銷售，包括蛋白質(zhì)、抗體、酶、培養(yǎng)基、試劑盒和儀器。適用于細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、診斷學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液分析和高通量藥物篩選等領(lǐng)域。

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