倒置 顯微鏡（Inverted Microscope）是一種專門設計用于觀察培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)瓶等容器中樣品的顯微鏡，廣泛應用于細胞生物學、組織學、分子生物學、微生物學以及其他生物醫(yī)學研究中。與傳統(tǒng)的正置顯微鏡不同，倒置 顯微鏡的物鏡位于樣品的下方，而光源位于樣品的上方。這種的設計使倒置 顯微鏡非常適合用于觀察細胞培養(yǎng)、活體細胞和厚樣品，特別是那些依賴液體環(huán)境進行生長的貼壁細胞和懸浮細胞。

倒置顯微鏡最早由荷蘭物理學家**費爾納爾斯·霍爾登（Frits Zernike）**于20世紀初設計，目的是解決正置顯微鏡在觀察厚樣品時的局限性?，F(xiàn)代倒置 顯微鏡通過結(jié)合相差顯微鏡、熒光顯微鏡、微分干涉顯微鏡等多種功能，廣泛應用于基礎研究、醫(yī)學、制藥、生物技術(shù)等領域。

一、倒置 顯微鏡的工作原理

倒置 顯微鏡的主要工作原理與正置顯微鏡相同，都是通過光學系統(tǒng)將物體放大，但其設計結(jié)構(gòu)與光路有所不同。倒置 顯微鏡的物鏡安裝在載物臺下方，光源位于樣品的上方，光線從樣品上方透過樣品傳輸至下方的物鏡。通過這樣的設計，用戶可以在不影響樣品液體環(huán)境（如細胞培養(yǎng)液）的情況下，直接觀察底部貼壁生長的細胞。

倒置 顯微鏡主要通過以下幾個光學步驟完成成像過程：

1. 光源照射：光源從上方向下照射樣品，樣品中的光線經(jīng)過樣品底部傳入物鏡。

2. 物鏡放大：物鏡首先對光線進行初步放大，形成放大的圖像。

3. 目鏡放大：目鏡進一步放大物鏡形成的圖像，最終呈現(xiàn)給觀察者。

4. 圖像形成：最終成像可以通過目鏡直接觀察，也可以通過數(shù)碼相機記錄圖像。

二、倒置 顯微鏡的主要結(jié)構(gòu)與功能

倒置 顯微鏡的結(jié)構(gòu)設計與正置顯微鏡有一定的差異，以下是倒置 顯微鏡的主要組成部分：

1. 目鏡（Eyepiece）：

• 目鏡用于進一步放大物鏡形成的圖像，常見放大倍數(shù)為10x或15x。

2. 物鏡（Objective Lens）：

• 倒置 顯微鏡的物鏡位于樣品的下方，直接對樣品進行成像。物鏡的放大倍數(shù)通常為4x、10x、20x、40x以及100x。倒置 顯微鏡特別適合用于低倍至中倍放大倍率的觀察。

3. 載物臺（Stage）：

• 載物臺是用于放置樣品的區(qū)域，通常設計為大面積的平面臺，適合放置培養(yǎng)皿、多孔板或組織培養(yǎng)瓶。載物臺帶有夾具或滑動平臺，便于樣品的移動和對焦。

4. 光源與照明系統(tǒng)：

• 倒置 顯微鏡通常使用LED或鹵素燈作為光源，光線從樣品的上方照射，透過樣品進入物鏡。倒置 顯微鏡的光源可調(diào)節(jié)亮度，以適應不同樣品的觀察需求。

5. 調(diào)焦旋鈕（Focus Knob）：

• 調(diào)焦旋鈕分為粗調(diào)和微調(diào)，粗調(diào)用于快速對焦，微調(diào)用于精確調(diào)整焦距，特別是在高倍觀察時，微調(diào)對于圖像的清晰度至關重要。

6. 相差裝置（Phase Contrast Device）：

• 倒置 顯微鏡常配備相差觀察裝置，適用于無染色樣本的觀察，特別是細胞培養(yǎng)實驗中，用于觀察活細胞的輪廓和結(jié)構(gòu)。

7. 熒光模塊（Fluorescence Module）：

• 倒置 顯微鏡通常配備熒光模塊，用于觀察熒光標記的樣本。熒光觀察適合分子生物學、基因表達、蛋白質(zhì)定位等實驗。

8. 數(shù)字成像系統(tǒng)：

• 倒置顯微鏡可連接數(shù)碼相機或CCD攝像頭，通過成像軟件實時捕捉和分析樣本圖像，記錄細胞動態(tài)變化和實驗結(jié)果。

三、倒置 顯微鏡的分類

根據(jù)應用場景和觀察方式的不同，倒置 顯微鏡可以分為以下幾種常見類型：

1. 明場倒置 顯微鏡（Bright-Field Inverted Microscope）

• 明場顯微鏡是最常見的倒置 顯微鏡類型，光線通過樣品的透射光進行成像。它適合觀察經(jīng)過染色的細胞、組織切片以及透明度較高的懸浮細胞。明場顯微鏡的成像對比度低，適用于染色或透明樣本。

2. 相差倒置顯 微鏡（Phase Contrast Inverted Microscope）

• 相差顯微鏡利用光的相位差原理，提高透明樣本的對比度，尤其適合無染色的活體細胞或貼壁細胞的觀察。相差顯微鏡能夠清晰顯示細胞的邊界、細胞核和其他內(nèi)部結(jié)構(gòu)，廣泛用于細胞培養(yǎng)、細胞分裂觀察等實驗。

3. 熒光倒置 顯微鏡（Fluorescence Inverted Microscope）

• 熒光顯微鏡通過激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)，使其發(fā)出特定波長的光來成像，適合用于觀察特定分子或細胞內(nèi)的熒光標記。熒光顯微鏡在分子生物學、基因表達研究、蛋白質(zhì)標記等領域廣泛應用。

4. 微分干涉倒置 顯微鏡（Differential Interference Contrast (DIC) Inverted Microscope）

• 微分干涉顯微鏡通過干涉光路增強樣品的立體感和對比度，適合觀察無染色的厚樣品和透明細胞。DIC顯微鏡能夠顯示細胞的三維結(jié)構(gòu)，廣泛應用于生物樣本、胚胎發(fā)育研究等領域。

四、倒置 顯微鏡的應用領域

倒置 顯微鏡在生物學、醫(yī)學、制藥等多個領域中有著廣泛的應用，以下是常見的幾個應用場景：

1. 細胞培養(yǎng)與觀察

倒置 顯微鏡是細胞培養(yǎng)實驗中工具，尤其適合觀察貼壁細胞（如成纖維細胞、上皮細胞等）的生長、分裂和遷移過程。研究人員通過倒置 顯微鏡能夠?qū)崟r監(jiān)測細胞的形態(tài)變化、增殖、凋亡和藥物反應等。此外，懸浮細胞（如免疫細胞、血液細胞）也能通過倒置顯 微鏡進行觀察和分析。

2. 藥物篩選與毒性測試

在制藥領域，倒置 顯微鏡用于高通量藥物篩選實驗，通過觀察細胞對藥物的反應來評估藥物的效力和毒性。研究人員能夠通過成像系統(tǒng)記錄細胞在不同藥物作用下的形態(tài)變化、增殖抑制、凋亡等，進一步優(yōu)化藥物研發(fā)。

3. 活體細胞成像

倒置 顯微鏡能夠配合培養(yǎng)環(huán)境，進行長時間的活體細胞成像，適合細胞行為研究和動態(tài)變化的記錄。通過環(huán)境控制模塊（如溫度、CO2等），研究人員可以維持細胞在顯微鏡下的正常生長條件，進行長時間的實時觀察。

4. 胚胎發(fā)育與顯微操作

在胚胎學研究中，倒置 顯微鏡廣泛用于觀察胚胎發(fā)育、細胞分裂和組織形成過程。倒置 顯微鏡的大視場和長工作距離使其適合胚胎操作和顯微注射實驗，例如在小鼠胚胎或斑馬魚胚胎中進行顯微操縱和基因編輯。

5. 分子生物學與熒光成像

熒光倒置 顯微鏡是分子生物學實驗中的核心工具，廣泛應用于基因表達、蛋白質(zhì)標記、信號傳導等研究。通過熒光染料標記，研究人員可以精確定位細胞內(nèi)特定分子或結(jié)構(gòu)，觀察它們的動態(tài)變化。

五、倒置 顯微鏡的使用步驟

以下是使用倒置 顯微鏡進行細胞觀察的常規(guī)步驟：

1. 樣本準備

將細胞或組織樣本放置在培養(yǎng)皿、多孔板或組織培養(yǎng)瓶中，確保樣本貼壁生長或分布均勻。

2. 安裝樣本

將準備好的樣本放置在載物臺上，并使用夾具固定樣品。調(diào)節(jié)載物臺的位置，使樣本位于物鏡的正下方。

3. 選擇物鏡

根據(jù)實驗需要選擇合適的物鏡，通?？梢詮?x或10x開始觀察整體結(jié)構(gòu)，再切換到20x或40x觀察細節(jié)。對于貼壁細胞，高倍物鏡（如40x）適合用于觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

4. 調(diào)節(jié)光源與對焦

使用粗調(diào)焦旋鈕將樣本大致對焦，然后使用微調(diào)焦旋鈕進行精細調(diào)節(jié)，直到圖像清晰為止。調(diào)節(jié)光源亮度，確保樣本照明均勻。

5. 觀察與成像

在觀察的過程中，可以根據(jù)需要切換不同的觀察模式（如相差、熒光等）。通過數(shù)碼相機或CCD設備拍攝圖像，并通過成像軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

6. 關機與維護

實驗結(jié)束后，關閉光源和顯微鏡電源。清潔物鏡和其他光學元件，使用防塵罩保護顯微鏡，確保設備清潔和長時間穩(wěn)定使用。

六、倒置 顯微鏡的優(yōu)勢與局限性

優(yōu)勢

1. 適合細胞培養(yǎng)：倒置設計使得細胞培養(yǎng)皿和多孔板能夠直接放置，無需翻轉(zhuǎn)樣品，避免破壞細胞的培養(yǎng)環(huán)境。

2. 實時動態(tài)觀察：可以長時間連續(xù)觀察活體細胞，并通過成像設備記錄細胞的動態(tài)變化。

3. 多功能集成：倒置  顯微鏡可以結(jié)合相差、熒光、DIC等多種觀察模式，適應不同的實驗需求。

4. 大工作距離：適合厚樣品和三維組織的觀察，尤其在胚胎學和顯微操作中表現(xiàn)出色。

局限性

1. 高倍觀察性能有限：與正置顯微鏡相比，倒置 顯微鏡在高倍觀察時可能存在一定的局限性，特別是在100x物鏡下的分辨率和清晰度方面。

2. 樣品要求：由于物鏡位于下方，樣品需要在透明容器中進行觀察，否則會影響光的透射。

七、未來發(fā)展趨勢

隨著顯微鏡技術(shù)的進步，倒置 顯微鏡在功能上不斷擴展，以下是一些未來的發(fā)展趨勢：

1. 超分辨率成像：隨著超分辨率顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，倒置 顯微鏡將能夠突破光學衍射極限，實現(xiàn)納米級別的細胞成像，進一步推動細胞和分子生物學的研究。

2. 智能自動化：隨著人工智能和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，倒置 顯微鏡將逐漸實現(xiàn)自動對焦、樣本識別和自動成像，提高實驗效率和圖像處理速度。

3. 多功能集成：未來的倒置 顯微鏡將更具靈活性和多功能性，如結(jié)合共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡、拉曼顯微鏡等多種功能，進一步提高實驗數(shù)據(jù)的準確性和深度。

總結(jié)

倒置 顯微鏡憑借其的結(jié)構(gòu)設計和多功能擴展性，成為細胞生物學、組織學、藥物篩選等領域的工具。它能夠?qū)崿F(xiàn)活體細胞的長時間動態(tài)觀察，并通過結(jié)合熒光和相差等技術(shù)，幫助研究人員深入了解細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和行為。隨著顯微技術(shù)的不斷發(fā)展，倒置 顯微鏡將在生命科學研究中發(fā)揮越來越重要的作用。