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Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒產(chǎn)品歡迎您致電 華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 

產(chǎn)品原理

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒采用多重置換擴(kuò)增（MDA，Multiple Displacement Amplification）技術(shù)，對(duì)所有基因組位點(diǎn)進(jìn)行無偏差的擴(kuò)增。與基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)相比，該技術(shù)具有更好的擴(kuò)增保真度，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性信號(hào)。

儲(chǔ)存條件：-20°C

質(zhì)控

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒所有緩沖液和試劑生產(chǎn)都經(jīng)過嚴(yán)格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實(shí)驗(yàn)獲得可靠的結(jié)果。

安全信息

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒時(shí)，穿戴合適的實(shí)驗(yàn)防護(hù)·服，一次性手套和保護(hù)手套。詳細(xì)信息，參見SDS。

適用樣本

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒可使用各種臨床和非臨床研究樣品，包括已純化的基因組 DNA（gDNA）、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織。REPLI-g Single Cell 擴(kuò)增后DNA 產(chǎn)物平均長(zhǎng)度 >10 kb，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經(jīng)開發(fā)用于新一代測(cè)序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或 qPCR 分析。

應(yīng)用

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒適用于分子生物學(xué)應(yīng)用。該產(chǎn)品不適用于疾病的診斷、預(yù)防或治療。推薦依據(jù)NIH發(fā)布的重組DNA實(shí)驗(yàn)指南或其他指南使用所有Qiagen產(chǎn)品。

更詳細(xì)應(yīng)用領(lǐng)域：

人 / 動(dòng)物：生物標(biāo)志物研究（SNP、突變、CNV），干細(xì)胞研究，循環(huán)胎兒細(xì)胞的分析（產(chǎn)前檢測(cè)篩查），嵌合研究，遺傳易感性研究，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分型。

癌癥：體細(xì)胞遺傳變異分析，腫瘤發(fā)展，腫瘤干細(xì)胞 / 進(jìn)化，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的分析

細(xì)菌：宏基因組學(xué) (Metagenomics)，研究病原體分析，微生物基因分型。

植物 * ：氣孔研究，花粉分析。

* 無細(xì)胞壁的細(xì)胞或已純化的基因組 DNA。

下游應(yīng)用及儀器

全基因組測(cè)序、外顯子組測(cè)序：新一代測(cè)序平臺(tái) ?（Illumina等）

SNP 基因分型芯片、Array CGH：芯片平臺(tái) ?

qPCR/PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)定量 PCR/PCR 循環(huán)儀 ?

Sanger 測(cè)序：毛細(xì)管測(cè)序儀 ?

焦磷酸測(cè)序：PyroMark®（QIAGEN）

? 多個(gè)供應(yīng)商

例：全基因組測(cè)序流程

細(xì)胞樣本/基因組DNA——樣本處理——REPLI-g Single Cell Kit擴(kuò)增——新一代測(cè)序

組份規(guī)格

需要用戶自備材料

微離心管

水浴或其他加熱儀器

微型離心機(jī)

漩渦混合儀（Vortexer）

吸管和吸頭

冰

操作方法選擇

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒需要根據(jù)起始樣本選擇對(duì)應(yīng)操作方法

其他起始樣本：血漿血清、活檢、需要高通量擴(kuò)增的樣本等參見其他對(duì)應(yīng)說明書。

操作流程

方法*程

細(xì)胞樣本——加入變性混合液——65°C孵育10min——加入終止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA

方法二流程

純化基因組DNA——加入變性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA

方法一：從單細(xì)胞擴(kuò)增基因組DNA

實(shí)驗(yàn)開始前注意事項(xiàng)

1.適用樣本：1-1000個(gè)完整細(xì)胞

這個(gè)方法適用于所有物種的單細(xì)胞樣本，如：脊椎動(dòng)物，細(xì)菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌），植物（細(xì)胞壁已脫），分選細(xì)胞，組織培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞。

不適用樣本：福爾馬林固定樣本或其他使用交聯(lián)劑固定的樣本，如：從福爾馬林固定石蠟包埋組織中激光顯微切割得到的單細(xì)胞樣本。

2.小心試劑不要被外源DNA污染。如：使用干凈獨(dú)立吸頭吸管，在無外源DNA地方進(jìn)行反應(yīng)操作。

3.純化基因組DNA擴(kuò)增參見方法二。

4.聚合酶要在冰上解凍（見步驟6）。其他成分可以室溫解凍（15–25°C）。

5.配制的D2緩沖液（變性緩沖液）存放不要超過3個(gè)月。

6.陰性對(duì)照（無模板）的DNA產(chǎn)量約 40 µg。因?yàn)?/span>REPLI-g 的單細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)中，引物二聚體的隨機(jī)擴(kuò)增得到高分子量的DNA產(chǎn)物。這一DNA不會(huì)影響實(shí)際樣本質(zhì)量，也不會(huì)影響下游分析造成陽性結(jié)果。

開始前準(zhǔn)備

試劑預(yù)處理

1.DLB緩沖液加500µl試劑盒的水混勻，稍微離心溶解。

注意：重組的DLB緩沖液–20°C能放6個(gè)月。

Buffer DLB is pH-labile.

2.所有緩沖液和試劑使用前都要用漩渦混合器充分混勻。

儀器預(yù)設(shè)

3.水浴，heating block或熱循環(huán)儀溫度設(shè)為30°C。

如果熱循環(huán)儀帶加熱蓋，蓋子溫度設(shè)為70°C。

步驟

一 變性

1.按表1配制足量（整個(gè)擴(kuò)增流程所需）D2緩沖液（變性緩沖液）。

注意：表中提供的D2緩沖液用量足夠進(jìn)行12次反應(yīng)。沒用完的D2緩沖液–20°C 存放，但不要存放超過3個(gè)月。

表1.D2緩沖液配制

2. 4 µl樣本細(xì)胞（含PBS）加入微離心管。如果細(xì)胞不夠4 µl，加PBS sc補(bǔ)齊。

注意：REPLI-g單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒提供的PBS sc量不夠用于樣本細(xì)胞的連續(xù)稀釋。

可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）

3.加入3 µl 配制的D2緩沖液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。

注意：確保樣本細(xì)胞沒有貼在緩沖液線上的管壁。

4.65°C孵育10min。

1. 加入3 µl 終止液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。冰上保存。

二 擴(kuò)增

6.冰上解凍REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室溫解凍，漩渦振蕩后稍微離心。

解凍后REPLI-g sc反應(yīng)緩沖液可能會(huì)形成沉淀，漩渦振蕩10s可以溶解沉淀。

7.按表2配制master混合液?；靹颍晕㈦x心。

要點(diǎn)：嚴(yán)格按照表2所列順序配制。加入水和反應(yīng)緩沖液后，稍微漩渦振蕩和離心后再加入DNA聚合酶。

注意：一次性進(jìn)行多次反應(yīng)時(shí)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。

表2：master混合液配制

多次反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加劑量并增加10%。

8.每次反應(yīng)，10 µl 變性DNA（步驟5）加入40 µl master 混合液。

9.30°C孵育8h。

30°C孵育后，水浴或其他加熱儀可以改設(shè)為65°C方便步驟10使用。

注意：如果使用帶加熱蓋的熱循環(huán)儀，蓋子溫度設(shè)為70°C。

10.DNA聚合酶65°C滅活3min。

擴(kuò)增產(chǎn)物儲(chǔ)存

11.如果不直接使用，擴(kuò)增所得DNA 短期儲(chǔ)存在4°C，長(zhǎng)期儲(chǔ)存在–20°C。

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒的DNA可以當(dāng)作基因組DNA（zui低凍融循環(huán)），因此推薦zui低核酸儲(chǔ)存密度為100 ng/µl。

注意：避免多次反復(fù)凍融以確保DNA質(zhì)量。

下游應(yīng)用樣本處理

12.依照說明書用水或TE適量稀釋擴(kuò)增DNA。用于PCR分析的擴(kuò)增DNA按1:100稀釋，每次PCR反應(yīng)使用2 µl 稀釋后DNA。

13.擴(kuò)增DNA可用于一系列下游應(yīng)用，包括：第二代測(cè)序，array CGH和定量PCR。

注意：每50 µl典型反應(yīng)的DNA產(chǎn)量約40 µg，需要正確稀釋。擴(kuò)增DNA定量見附件A。

方法二：純化基因組DNA擴(kuò)增

略。詳情參見原版說明書。中文版翻譯可咨詢紅榮微再。

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